1.目的春砂仁为姜科豆蔻属阳春砂(Amomum villosum Lour.)的干燥成熟果实,是我国著名的“四大南药”之一。其主要药效物质挥发油中富含樟脑、龙脑、乙酸龙脑酯等萜类化合物。萜类合酶(terpene synthase,TPS)是萜类下游生物合成途径中的关键酶。前期研究已经从阳春砂转录组中筛选出了 22个TPS基因,并鉴定了其中部分为单萜合酶和倍半萜合酶。阳春砂中的萜类化合物十分丰富,尤其在药用部位果实中富含单萜和倍半萜及少量的二萜;并且随着果实的发育其萜类含量也有相应变化,但负责这些单萜、倍半萜和二萜化合物合成的TPS还有待全面挖掘。因此,本研究综合二代转录组和全长转录组数据挖掘更多的TPS基因,并对其进行克隆和功能鉴定,以期更全面地认识阳春砂挥发性萜类多样性及其在果实中积累的机制。启动子在植物基因表达调控中发挥着重要作用,萜类合酶基因的启动子调控基因的表达,进而影响植物萜类产物的合成。本论文也对阳春砂部分萜类合酶基因的启动子进行克隆,并分析其顺式调控元件,以期了解其调控相应萜类合成的机制。2.方法2.1阳春砂的全长转录组测序及TPS的挖掘以阳春砂叶、花、根、根状茎、45 DAF(Days after flowering)的种子团、75 DAF的种子团和果皮为材料,分别提取RNA,等量混合后进行全长转录组测序,对测序的质量和注释信息进行分析。根据已知的AvTPS1-22候选基因的序列在转录组数据中进行本地blast,再结合Pfam蛋白结构域,筛选出候选的AvTPS,进行生物信息学分析。2.2不同发育期果实中的挥发性萜类测定采用有机溶剂超声提取法,用正己烷提取30、45、60、75和90 DAF果皮和种子团中的挥发性萜类化合物,并用GC-MS对上述材料中的萜类化合物进行测定,用标准品制作标曲来对其进行定量。2.3基因的克隆与功能鉴定以目的基因表达量较高的组织部位cDNA为模板,克隆TPS基因,构建重组克隆载体,并以重组克隆载体为模板,采用In-fusion方法构建带有双His标签的pET32a或带有MBP标签的pMAL-c5X重组原核表达载体,转入Rosetta(DE3)表达菌株进行原核表达。利用IPTG诱导融合蛋白表达,用Ni-NTA柱或MBP柱纯化融合蛋白,并用底物GPP、FPP或GGPP进行体外酶促反应,GC-MS检测其催化产物。2.4荧光定量PCR使用primer premier 5.0设计用于qPCR的引物,以阳春砂不同发育期的果皮和不同发育期的种子团及叶、花、根状茎的cDNA为模板,进行荧光定量PCR。每个样品包含两个生物学重复,两次技术重复,基因表达水平以2-ΔΔCT进行归一化处理。2.5 AvBPPS和AvLIS/NES启动子克隆与分析提取阳春砂叶片的基因组DNA(genomic DNA,gDNA),以其为模板,克隆AvBPPS和AvLIS/NES的gDNA序列。在获得的gDNA序列的基础上设计三条方向一致的特异引物,用融合引物与巢式聚合酶链式反应(fusion primer and nested integrated PCR,FPNI-PCR)扩增其启动子序列,并分析启动子的转录起始位点以及顺式作用调控元件。3.结果3.1阳春砂全长转录组数据分析及AvTPS挖掘全长转录组数据分析发现其组装质量较好,所获得的isoform序列普遍较长,在Nr数据库中注释率高达93.98%;在KEGG代谢通路中,次生代谢生物合成途径中注释到的isoform最多;在萜类骨架合成途径中,MEP途径注释到的isoform多于MVA途径。综合阳春砂前期的多个转录组数据,共筛选出了 24个候选的AvTPS。将24个候选基因构建系统发育树并聚类到7个不同的亚家族中,其中单萜合酶主要聚类到TPS-b亚家族,倍半萜合酶主要聚类到TPS-a亚家族,二萜合酶主要聚类到TPS-c和d亚家族。3.2 AvTPS基因的克隆及功能鉴定3.2.1七个AvTPS基因被克隆并成功获得11个AvTPS的纯化蛋白本研究从候选基因中成功克隆了其中7个AvTPS,包括3个预测为单萜合酶的基因—AvTPS12、AvTPS13、AvTPS23,2个预测为倍半萜合酶的基因一AvTPS14、AvTPS24和2个预测为二萜合酶的基因AvTPS20、AvTPS21,均构建了原核表达载体。对前人已克隆但未获得纯化蛋白的基因(AvTPS4、AvTPS8、AvTPS16和AvTPS17)更换表达载体来表达蛋白。其中AvTPS4、AvTPS8、AvTPS16、AvTPS17和AvTPS23在双His标签原核表达载体中表达蛋白时出现包涵体,随后构建到含MBP标签的原核表达载体中,增加蛋白的可溶性。最后,11个AvTPS均获得了纯化的蛋白。3.2.2成功鉴定了 9个AvTPS的酶功能单萜合酶AvTPS13和AvTPS23与GPP反应主产物均为β-Ocimene,分别命名为β-罗勒烯合酶1(β-Ocimene synthase l,AvOCSl)和β-罗勒烯合酶2(β-Ocimene synthase 2,AvOCS2)。倍半萜合酶 AvTPS4 与 FPP 反应产生单一产物 trans-Nerolidol,命名为反式-橙花叔醇合酶(trans-Nerolidol synthase,AvtNES)。AvTPS12、AvTPS14、AvTPS16和AvTPS24均被鉴定为双功能酶,它们在体外既能与GPP反应产生单萜类产物,也能与FPP反应产生倍半萜产物。AvTPS12与GPP反应的主产物为linalool以及若干副产物;与FPP反应产生单一产物nerolidol,命名为芳樟醇/橙花叔醇合酶(linalool/nerolidol synthase,AvLIS/NES)。AvTPS14与GPP和FPP反应的主产物分另为geranyl methyl ether和copaene,均含有若干副产物,命名为可巴烯合酶(copaene synthase,AvCOS)。AvTPS16与GPP和FPP反应的主产物分别为geranyl methyl ether和aristolochene,同时也生成若干副产物,命名为马兜铃烯合酶(aristolochene synthase,AvARS)。AvTPS24与 GPP 和 FPP 反应的主产物分别为 geranyl methyl ether 和 bicyclogermacrene,均产生若干副产物,命名为双环大牻牛儿烯合酶(bicyclogermacrene,AvBES)。AvTPS20和AvTPS21与GGPP反应产生单一产物柯巴基二磷酸(copalyl diphosphate),脱磷酸后产生copalol,分别命名为柯巴醇合酶1(copalol synthase 1,AvCPS1)和柯巴醇合酶 2(copalol synthase 2,AvCPS2)。AvTPS8 和 AvTPS17与GPP和FPP反应均未检测到产物。本文发现4对AvTPS的催化产物相似,并且它们的序列比对相似度较高,分别为AvTPS2和AvTPS12,AvTPS13和AvTPS23,AvTPS14和AvTPS24,以及AvTPS20和AvTPS21。此外,所有的双功能合酶与GPP反应均生成了 geranyl methyl ether,且 AvTPS12 还产生了 linalool methyl ether,两者均为醇甲醚。3.3阳春砂果实中含有丰富且多样的挥发性萜类阳春砂不同发育时期果实中检测到的挥发性萜类的种类和含量均较丰富,共检测到了 49种萜类化合物,其中果皮共有31种挥发性萜类,包括19种单萜,9种倍半萜和3种二萜;种子团共含有48种挥发性萜类,包括24种单萜,22种倍半萜和2种二萜,比果皮中丰富。本文首次比较了5个不同发育期果实中的挥发性萜类,绝大部分种子团中的挥发性萜类含量高于其在果皮中的含量。随着果实的发育,果皮中的挥发性萜类总体变化不大,而种子团中的挥发性萜类逐步积累,并在75 DAF积累量达到最高。主要药效物质乙酸龙脑酯在种子团中富集,且从45DAF即开始富集。3.4 AvTPS表达模式与萜类产物的相关性分析将已鉴定功能的15个AvTPS在不同发育期果实和不同组织部位中的表达量与其萜类产物进行相关性分析。15个AvTPS在种子团中均有表达,其中AvBPPS表现出种子表达特异性,在45 DAF种子团中表达量最高,主要参与种子团中莰烯、龙脑以及乙酸龙脑酯、樟脑的合成。AvCOS和AvBIS均在45 DAF种子团中表达量最高,分别主要负责种子团中copaene和bicyclogermacrene的合成。AvLIS和AvLIS/NES功能相似,但表达模式不同,AvLIS主要在果皮中表达,且在45 DAF果皮中表达量最高,主要负责果皮中Linalool的合成,而AvLIS/NES在花中表达量最高,主要参与花中linalool的合成。AvOCSl和AvOCS2产物相似,而表达模式不同——AvOCS1在60DAF果皮中表达量最高,主要参与果皮中β-Ocimene的合成;AvOCS2在叶片中表达量最高,主要参与叶片中的β-Ocimene的合成。AvCPS1和AvCPS2在各组织部位均有表达,均在45 DAF果皮中表达量最高,AvCPS1的表达量高于AvCPS2的表达量。AvPIS在大部分组织部位(除根状茎)中均有表达,在60 DAF果皮中表达量最高,主要参与果皮中的蒎烯合成,且蒎烯普遍存在于各个组织部位中,AvPIS的表达量与蒎烯的积累相关。3.5获得AvBPPS和AvLIS/NES的启动子克隆获得的AvBPPS和AvLI/SNE的gDNA片段序列长度分别为2374 bp和2295 bp,均包含7个外显子和6个内含子及对应基因完整的开放阅读框(open reading frame,ORF)。向 GenBank提交了 AvBPPS 和 AvLIS/NES的 gDNA序列,分别获得序列号MG763230和MN829545。用FPNI-PCR法克隆启动子,AvBPPS和AvLIS/NES在已获得其阳春砂叶片基因组的基础上进一步扩增其启动子,测序结果表明AvBPPS和AvLIS/NES与其gDNA 5’端有264 bp和156 bp的重叠序列,初步确认获得了 AvBPPS和AvLIS/NES的启动子序列。3.6 AvBPPS和AvLIS/NE启动子分别含有参与胚乳表达和涉及MeJA反应的顺式作用调控元件将获得的AvBPPS和AvLIS/NES的启动子序列进行生物信息学分析发现,AvBPPS启动子中包含GCN4-motif(TGAGTCA)——参与胚乳表达的顺式作用调控元件,还有G-Box——参与光响应的元件,此外,还含有参与脱落酸反应、低温响应、MYB结合等元件。本文发现AvBPPS启动子中含有GCN4-motif,荧光定量PCR和转录组数据分析结果表明AvBPPS在种子中特异表达,且其相应的萜类产物乙酸龙脑酯、樟脑、龙脑等在种子中富集。AvLIS/NES启动子中含有涉及茉莉酸甲酯反应的顺式作用调控元件CGTCA-motif/TGACG-motif;还含有参与脱落酸反应的AAGAA-motif和ABRE以及参与光响应的G-box。结合MeJA处理的阳春砂数据发现,AvLIS/NE响应MeJA的诱导且其对应萜类产物芳樟醇的含量也受MeJA的调控。4.结论本文共筛选出了 24个候选的AvTPS,成功克隆并鉴定了 9个AvTPS,将阳春砂中所有已鉴定功能的AvTPS进行分析,发现绝大部分AvTPS均为多产物酶,预测为倍半萜合酶的基因均为双功能合酶基因。将所有已鉴定功能的AvTPS在不同发育期果实和不同组织部位中进行表达量分析,发现这些基因均在种子团中有表达;其中AvBPPS和AvCOS均在种子团中特异表达,AvBPPS是负责主要药效成分龙脑、乙酸龙脑酯等合成的关键酶,AvCOS是萜类产物多样性最高的酶。AvTPS的产物多样性及其在种子中的表达是阳春砂主要药效萜类在种子中富集及其多样性的基础。其中有3对AvTPS序列相似,催化产物也相似,而它们的表达模式不同,揭示了阳春砂TPS基因家族中的相似基因在不同的组织部位发挥功能。本文首次从药用植物阳春砂AvBPPS的启动子中发现了参与胚乳表达的顺式作用调控元件,为深入探究萜类合成关键酶的种子表达特异性的机制提供了基础,为萜类代谢的调控提供了操作元件。