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布鲁氏菌病是由于布鲁氏菌(Brucella)入侵机体引起的以流产、发热为主要特征的一种人兽共患病,对人和动物的健康造成严重威胁。布鲁氏菌为兼性胞内寄生的革兰氏阴性菌,毒力主要表现慢性持续性感染。布鲁氏菌可以通过形成布鲁氏菌泡(Brucella-containing vacuole,BCV)来逃逸宿主溶酶体的降解,实现胞内生存和复制,同时布鲁氏菌感染不会造成细胞凋亡,能够避免机体免疫系统的识别和清除,从而达到自身在宿主细胞内长期生存并引起持续感染的目的。布鲁氏菌IV型分泌系统(Type IV secretion system,T4SS)是由12个基因编码的蛋白组成的复合物,其贯穿布鲁氏菌的细胞壁和外膜,是布鲁氏菌致病的主要毒力因子。T4SS主要通过分泌效应蛋白来干扰宿主细胞的正常功能,其分泌的效应蛋白近些年被不断发现,但是大多数效应蛋白的功能和作用机制未知。其中BPE123和BPE043作为效应蛋白,在布鲁氏菌胞内生存过程中的功能和机制还不清楚。因此本文对二者在宿主细胞内的互作蛋白以及二者对布鲁氏菌胞内生存的影响开展研究,具体如下:(1)BPE123互作靶蛋白IFT20的鉴定及其对布鲁氏菌胞内生存的影响研究。我们前期研究证明BPE123是布鲁氏菌胞内生存的重要毒力因子。本研究通过激光共聚焦实验发现BPE123表达后呈囊泡状定位在HeLa细胞的细胞核周围,提示其可能参与了宿主细胞的囊泡运输;通过酵母双杂交筛选人脾脏cDNA文库,并通过双向免疫共沉淀鉴定了BPE123的靶蛋白为IFT20;在HeLa细胞中利用si RNA干扰IFT20的表达或构建IFT20稳定低表达细胞系和IFT20单敲除细胞系,建立布鲁氏菌感染模型,结果显示布鲁氏菌在各种IFT20低表达细胞系中胞内生存能力均增强。(2)BPE123和IFT20相互作用对细胞自噬的影响。通过Western Blot检测BPE123和IFT20过表达时自噬相关蛋白的表达变化,发现IFT20的过表达可以促进自噬,BPE123的过表达可以抑制自噬,而两者共表达时BPE123可以拮抗IFT20诱导的细胞自噬。IFT20的敲减可以降低BPE123诱导的自噬抑制作用。(3)效应蛋白BPE043是布鲁氏菌的毒力因子。通过同源重组的方法构建布鲁氏菌bpe043基因缺失株Δbpe043。将布鲁氏菌野生株104和Δbpe043在相同的起始浓度下培养,观察它们生长变化的趋势,发现二者在体外培养的生长趋势基本相同;用野生株和缺失株分别感染小鼠,构建小鼠体内感染模型,测定小鼠脾重并计算脾脏细菌载量,结果显示:在感染一周后,两组小鼠脾均肿大,但Δbpe043感染组小鼠脾重低于野生株104感染组;在感染后两周,两组小鼠脾肿大现象开始减轻。在细菌载量方面,在感染1周后,Δbpe043感染小鼠的脾脏细菌载量低于野生株104感染小鼠;在感染后2周,Δbpe043感染组的脾细菌载量下降趋势更明显。利用免疫共沉淀技术筛选BPE043蛋白的宿主互作蛋白,找到了它的互作蛋白为鼠源小分子GTP结合蛋白Rab4和Rab11。通过对布鲁氏菌IV型分泌系统效应蛋白BPE123和BPE043的生物学功能初步研究,为进一步研究布鲁氏菌如何通过分泌效应蛋白来干扰宿主细胞信号通路、通过调节自噬来促进布鲁氏菌胞内生存做出了铺垫。为布鲁氏菌的防治和疫苗研发奠定了基础。