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研究目的机械力对维持牙周组织健康起到了非常重要的作用,过大的机械力刺激可引起牙周组织发生无菌性炎症。牙周膜（Periodontal ligament,PDL）是牙周组织受到机械应力的直接效应组织,前期研究表明机械牵张力加载可使人牙周膜细胞（Human periodontal ligament cells,HPDLCs）中的炎症体及天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶（Cysteine protease with aspartic acid specificity,Caspase）发生活化,诱导细胞发生焦亡、释放白细胞介素1β（Interleukine-1 beta,IL-1β）和白细胞介素18（Interleukine-18,IL-18）等促炎细胞因子等炎症反应,但其中炎症体在力刺激下活化的具体机制尚未完全明了。最近的研究表明,活性氧（Reactive oxigen species,ROS）在机械应力引起的炎症反应中具有重要的调控作用,且有相关假说认为ROS为炎症体活化的上游因子,因此本课题旨在探讨ROS在机械力刺激诱导HPDLCs炎症反应中的作用及其机制,以进一步揭示力刺激诱导牙周组织炎症反应的机理。研究方法1.收集因正畸需要拔除的健康前磨牙,刮取根中1/3的牙周膜,采用组织块法进行HPDLCs原代培养并传代,使用4-6代的细胞用于牵张加载实验,采用Flexcell FX-5000体外牵张加载装置,模拟人体内牙周膜的受力情况,对体外培养的HPDLCs加载牵张应变。2.对体外培养的HPDLCs分别施加3h、6h、12h和24h的20%牵张应变。采用二氯荧光黄双乙酸盐（2’,7’–dichlorofluorescin diacetate,DCFDA）作为荧光探针,流式细胞术检测HPDLCs中ROS的产生情况。3.对体外培养的HPDLCs分别施加3h、6h、12h和24h的20%牵张应变,采用酶联免疫吸附技术（Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）检测IL-1β及IL-18的蛋白释放量。对体外培养的HPDLCs施加6h的20%牵张应变,采用Annexin V/PI双染法和流式细胞术检测HPDLCs焦亡率。4.对体外培养的HPDLCs预先用apocynin阻断细胞中ROS的生成,施加6h的20%牵张应变,Annexin V/PI双染法和流式细胞术检测细胞焦亡率,并与未阻断ROS的牵张加载后细胞进行比较;免疫印迹技术检测ROS阻断前后牵张加载下IL-1β前体蛋白（pro-IL-1β）、活化态蛋白（mature-IL-1β）、IL-18、NLRP3及caspase-1表达水平的变化;ELISA检测IL-1β及IL-18蛋白释放量的变化;Caspase-1酶活性检测试剂盒检测caspase-1蛋白酶活性的变化。明确ROS在牵张应变诱导HPDLCs发生焦亡,表达、释放IL-1β及IL-18,活化NLRP3和caspase-1蛋白酶等过程中的作用。5.对体外培养的HPDLCs采用特异性蛋白酶活性抑制剂阻断caspase-1蛋白酶活性,施加6h的20%牵张应变,Annexin V/PI双染法和流式细胞术检测阻断前后细胞焦亡率的差异;免疫印迹技术检测IL-1β前体蛋白（pro-IL-1β）、活化态蛋白（mature-IL-1β）及IL-18表达的变化;ELISA检测IL-1β及IL-18蛋白释放量的变化。明确caspase-1蛋白酶在牵张应变诱导HPDLCs发生炎症反应过程中的作用,及在此过程中其与ROS的上下游关系。研究结果1.采用组织块法在体外成功培养获得HPDLCs。2.对HPDLCs加载20%牵张应变3h、6h后细胞内ROS水平均高于未加载牵张应变的对照组（3h组P<0.05,6h组P<0.001）,12h与24h加载组ROS表达量降至对照组水平（P>0.05）。3.ELISA结果显示,牵张加载6h后HPDLCs IL-1β、IL-18蛋白释放量均较对照组明显上调（IL-1β:P<0.001;IL-18:P<0.05）,12h加载组的IL-18释放量较对照组也明显上调（P<0.01）。流式细胞术结果显示,牵张加载6h后,HPDLCs的焦亡率明显高于对照组（P<0.001）。4.采用apocynin阻断ROS生成后,加载牵张应变6h组的HPDLCs焦亡率较未阻断ROS、单纯牵张加载组下调（P<0.001）。ELISA结果显示,6h加载组IL-1β、IL-18蛋白释放量也较未加阻断剂、单纯牵张加载组下调（P<0.05）;12h加载组的IL-18的蛋白释放量也较未加阻断剂、单纯牵张加载组下调（P<0.01）。免疫印迹试验结果显示,单纯牵张加载6h组IL-1β、IL-18、caspase-1、NLRP3蛋白表达水平较未加载牵张应变的对照组增加,而阻断ROS则明显抑制了牵张加载后细胞中上述蛋白表达的上调。Caspase-1酶活性检测结果显示,单纯牵张加载6h组细胞中caspase-1蛋白酶活性较对照组明显上调（P<0.001）,而阻断ROS则明显抑制了牵张加载后细胞中caspase-1蛋白酶活性的上调（P<0.001）。5.特异性阻断caspase-1蛋白酶活性后,牵张加载6h组HPDLCs焦亡率较单纯牵张加载组下调（P<0.05）;IL-1β、IL-18蛋白释放量也较单纯牵张加载组下调（IL-1β:P<0.05;IL-18:P<0.001）;IL-1β、IL-18蛋白表达量也较单纯牵张加载组下调。结论ROS参与了力刺激诱导HPDLCs发生的炎症反应过程。20%牵张应变使HPDLCs中的ROS表达增加,ROS通过caspase-1参与调控牵张应变诱导下HPDLCs发生的焦亡以及IL-1β和IL-18等炎症因子的表达及释放。本研究为进一步阐明力刺激引起HPDLCs炎症反应和牙周组织炎症的信号调控机制提供了试验数据,并为今后将抗氧化作为防治力相关牙周炎症疾病的新策略提供了参考。