研究背景：随着恶性肿瘤化学治疗的进展,很多患者可以长期存活,有的甚至可以完全治愈。然而这些女性患者在化疗后,都不同程度地出现了月经失调、轻重不等的卵巢功能衰竭并导致不育。其中,最常见的是卵巢功能早衰(Premature ovarian failure, POF)。主要表现为应用化疗药物后出现永久性闭经和生殖器官萎缩,并伴有卵泡刺激素(follicle-stimulating hormone, FSH)和促黄体生成素(luteinizing hormone, LH)升高、雌激素(estradial, E2)降低的综合征,出现围绝经期综合征症状,如潮热、多汗、面部潮红、情绪不稳定、性欲低下、阴道干涩等,甚至不孕。目前,对化疗所致的卵巢早衰的机制还不是很明确,Meirow D提出细胞凋亡是化疗药物引起卵巢结构及功能破坏的重要机制。受化疗药物影响,卵泡内的一些特定的信号被激活而促使细胞发生凋亡,抑制此过程就有可能抑制凋亡从而保护卵巢功能。TillyJL也通过研究发现化疗后卵母细胞的凋亡可能是由神经酰胺和1-磷酸鞘氨醇介导的。神经酰胺作为一种鞘脂类分子在凋亡中起着信号传递的作用。Morita Y对缺乏产生神经酰胺的酶即酸性神经磷脂酶的小鼠应用凋亡抑制剂1-磷酸鞘氨醇治疗发现可抑制化疗药物阿霉素造成的卵细胞的凋亡。此外还有化疗药导致卵巢组织纤维化和自身免疫等因素存在。近年来,人们纷纷采取各种方法来预防或治疗化疗性卵巢早衰,如采用促性腺激素释放激素激动剂(gonadotropin releasing hormone agonist,GnRHa)和化疗药物合用来治疗Hodgkin’s病、乳腺癌和其他恶性肿瘤,或狼疮性肾病的病人,可显著地降低幸存者中发生POF的比率。还有学者提出采用冷冻保存技术,包括冷冻胚胎、冷冻卵巢组织移植及冷冻卵母细胞和体外成熟等,但均不尽人意。随着干细胞的研究逐渐深入,我们课题组对骨髓间充质干细胞(bone marrow-derived mesenchymal stem cells, BMSCs)治疗卵巢早衰进行了研究,结果发现大鼠骨髓间充质干细胞的卵巢移植对于治疗化疗所致的卵巢早衰有明显的治疗作用,表现为大鼠卵巢各级卵泡数增加,雌二醇浓度明显上升,FSH浓度明显下降,表明BMSCs能修复卵巢结构,改善卵巢内分泌功能；其机制考虑与BMSCs能分泌血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、胰岛素样生长因子-1(insulin-like growth factors-1, IGF-1)、肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor,HGF)等因子,抑制卵巢颗粒细胞凋亡有关。但由于BMSCs存在病毒、细菌污染的可能,从化疗患者骨髓中提取的间充质干细胞潜在的致瘤的可能性较高,而且随着患者年龄增长其细胞数量和扩增、分化能力出现明显下降趋势,使研究和应用受到限制。因而,来源于胎儿附属器的脐带间充质干细胞和胎盘间充质干细胞由于其取材容易,不会对患者造成二次损伤,病毒和细菌的污染率低,免疫原性低等特点,有可能成为更好的替代细胞。因此,我们选择了对人胎盘和脐带中提取的间充质干细胞进行比较,并根据其细胞学特性选择合适的替代细胞。在选定了替代细胞后,通过在体外建立化疗性卵巢早衰的大鼠模型,PKH26标记细胞后进行卵巢注射移植和尾静脉注射移植,荧光显微镜观察人脐带间充质干细胞移植后的卵巢情况,检测大鼠E2、FSH的水平和阴道涂片的改变,分批量处死大鼠,观察大鼠的病理组织改变,包括卵巢HE染色观察组织形态学变化和卵泡计数,荧光显微镜观察间充质干细胞存活的情况和间充质干细胞位置,并观察各组大鼠的生育情况和后代的生长发育情况,从而探讨在化疗性卵巢早衰中最适合的间充质干细胞来源和最适合的移植方式。第一章人脐带及胎盘间充质干细胞的选择性应用研究目的：建立人脐带间充质干细胞和胎盘间充质干细胞在体外分离、培养的方法,并对其进行鉴定；检测人脐带及胎盘来源的间充质干细胞的生物学特性,进行比较研究；研究人脐带和胎盘来源的间充质干细胞内部和表面的超微结构,进行对比研究。方法：1.无菌条件下提取剖宫产出生的健康足月新生儿的脐带和胎盘,人脐带间充质干细胞采用贴壁法,胎盘间充质干细胞采用胶原酶消化结合贴壁法进行原代培养,置DMEM培养液(含10%胎牛血清)中培养,待细胞融合到80%-90%时,1：3传代。采用流式细胞仪检测两种细胞的表面标志,通过检测抗人CD29、CD73、CD105、CD90、CD14、CD34、CD45、CD106、CD133、HLA-DR等对细胞进行鉴定,光镜下观察细胞形态。2.使用细胞计数试剂盒(Cell Counting Kit-8, CCK-8)研究两种来源的间充质干细胞的增殖和生长特性,PI染色法测定细胞周期,细胞凋亡检测试剂盒(AnnexinⅤ-FITC)检测凋亡情况,实时荧光定量反转录聚合酶链式反应(reverse transcription-PCR, RT-PCR)检测两种间充质干细胞的血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)、类胰岛素生长因子-1(insulin-like growth factors-1, IGF-1)、肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor, HGF)的信使RNA(Messenger RNA, mRNA)表达情况,酶标记免疫吸附测定法(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)测定这两种间充质干细胞的VEGF、IGF-1、HGF分泌情况。3.透射电镜检测第2代脐带及胎盘来源的间充质干细胞的内部结构,同时采用原子力显微镜检测其表面结构。结果：1.原代培养的胎盘及脐带来源的间充质干细胞均为贴壁细胞,细胞均呈梭形,有胞浆突起,为成纤维细胞样,胞浆丰富,核大,呈平行排列或旋涡状生长,漩涡中心细胞多层分布。传代后细胞生长迅速,待铺满全层后可稳定传代。所提取的间充质干细胞表达CD29、CD44、CD73、CD105、CD90;不表达CD14、CD34(造血干细胞抗原)、CD45(白细胞共同抗原)、CD106、CD133和HLA—DR(MHC—Ⅱ),提示所得贴壁细胞为人间充质干细胞,表达间充质干细胞特异性抗原标志而不表达造血干细胞、内皮细胞特异性抗原。2.cck-8检测第2代人脐带间充质干细胞与胎盘间充质干细胞的增殖能力。其中第1d-2d生长较慢,为生长潜伏期；第3d-6d生长速度增快,为对数生长期；此后细胞进入生长平台期。在对数生长期中,脐带间充质干细胞组的细胞倍增时间为(2.56±0.12)d,胎盘间充质干细胞组的细胞倍增时间为(2.96±0.20)d,两组对比有统计学差异；细胞周期检测也发现脐带间充质干细胞增殖较活跃,处于有丝分裂期和DNA合成期(G2/M+S)的细胞达30%以上,尤其是处于S期细胞为甚,明显高于胎盘间充质干细胞,经t检验有统计学差异,说明脐带间充质干细胞的增殖能力比胎盘间充质干细胞的要强。凋亡检测两种间充质干细胞各类细胞的比例,结果显示差异有统计学意义(P<0.05),说明胎盘间充质干细胞比脐带间充质干细胞的凋亡率高。实时荧光定量PCR证明了胎盘间充质干细胞和脐带间充质干细胞内有VEGF、IGF-1、HGF的mRNA的表达。ELISA检测发现两种间充质干细胞均可分泌能抑制细胞凋亡的细胞因子如VEGF、IGF-1、HGF,而以胎盘间充质干细胞分泌量多。3.在原子力显微镜下,脐带来源的间充质干细胞多为梭形细胞,少见扁平、不规则型细胞,而胎盘来源的间充质干细胞则可见扁平状、不规则细胞,并具有更多的伪足缠绕,部分伪足甚至编织成网状结构,提示胎盘间充质干细胞在粘附能力上可能更具优势,脐带间充质干细胞则更易于迁移分化。在对细胞内部进行透射电镜的检测中,我们的研究结果得到了进一步证实。两种来源的间充质干细胞多呈梭形,但胎盘来源的间充质干细胞可见扁平状、不规则细胞,微绒毛较多,说明其粘附能力较强；其线粒体结构与内分泌细胞的线粒体的超微结构相似,具有分泌细胞因子及相关激素的结构基础。而脐带间充质干细胞可见多量的自噬泡,说明细胞的自我更新能力强。结论：原代培养的胎盘及脐带来源的间充质干细胞,传代后生长迅速、稳定,表达CD29、CD44、CD73、CD105、CD90;不表达CD14、CD34、CD45、CD106、CD133和HLA—DR(MHC—Ⅱ),提示其表达间充质干细胞的特异性抗原,而不表达造血干细胞及内皮细胞的特异性抗原。cck-8检测及细胞周期检测提示第2代脐带间充质干细胞的增殖能力比胎盘间充质干细胞活跃,有统计学差异；凋亡检测胎盘间充质干细胞比脐带间充质干细胞的凋亡率高。在原子力显微镜及透射电镜下,见胎盘间充质干细胞呈扁平及不规则状,较多的微绒毛、伪足缠绕及网状结构,提示其在粘附能力上可能较强；而脐带间充质干细胞多为梭形细胞,可见多量自噬泡,提示其更易于迁移分化,细胞的自我更新能力强。第二章PKH26标记人脐带间充质干细胞的实验研究目的：检测及比较PKH26标记组和未标记组的人脐带间充质干细胞的细胞特性,了解PKH26标记对人脐带间充质干细胞的细胞特性的影响,评估其能否用于脐带间充质干细胞的标记。方法：CCK-8研究标记组和未标记组的间充质干细胞的增殖和生长特性,PI染色法测定细胞周期,Annexin-Ⅴ法检测凋亡情况,实时荧光定量PCR检测两组间充质干细胞的VEGF、IGF-1、HGF的mRNA表达情况,ELLISA测定两组间充质干细胞的VEGF、IGF-1、HGF分泌情况。透射电镜检测标记组和未标记组间充质干细胞的内部结构,同时采用原子力显微镜检测其表面结构。结果：PKH26标记对细胞的形态、增殖能力、凋亡及周期均无明显影响,细胞超微结构无明显变化,VEGF、IGF-1、HGF的基因表达无明显改变,在体外标记中,细胞传代到5代时,荧光强度明显减弱,考虑随细胞分裂,子细胞膜上的荧光染料随之减少所致。结论：PKH26标记脐带间充质干细胞是切实可行的方法。第三章大鼠卵巢注射和尾静脉注射人脐带间充质干细胞的初步免疫学研究与比较目的：了解大鼠对于人脐带间充质于细胞是否存在天然免疫耐受,了解不同的用药途径,如卵巢移植和尾静脉移植后人脐带间充质干细胞在大鼠体内各脏器的分布情况,客观分析人脐带间充质干细胞在大鼠体内出现免疫排斥的可能。方法：实验分3组,每组5只大鼠,均为雌性wista近交系大鼠,体重180g-200g,阴道涂片有正常的发情周期。第1组为对照组,不做任何处理。第2组为卵巢注射组,每只大鼠两侧卵巢移植20μ1(浓度为5×107/m1)标记了PKH26的人脐带间充质干细胞。第3组为尾静脉注射组,每只大鼠尾静脉移植1ml(浓度为1×106/m1)标记了PKH26的人脐带间充质干细胞。移植成功后,观察3组大鼠的一般情况,如进食、活动、大小便、精神状况等,特别注意大鼠有无嗜睡、呕吐、抽搐、猝死、无尿、精神状态异常及偏瘫等有关器官栓塞的症状,与此同时,留意大鼠有无出现相关移植免疫排斥的症状,如呼吸困难、出血、脱毛、血尿、血便等急慢性免疫排斥反应。移植成功1月后,处死对照组和移植组大鼠,取大脑、肝、肾、卵巢、子宫等器官进行冰冻切片,即刻在荧光显微镜下观察PKH26标记的脐带间充质干细胞在大鼠相关脏器中的分布情况,随之进行HE染色,了解各器官的病理改变。结果：两种方法(卵巢注射及尾静脉注射)移植人脐带间充质干细胞的大鼠,均未出现明显的呼吸困难、出血、脱毛、血尿、血便等急慢性免疫排斥反应,其脑、肝、肾、卵巢、子宫的病理切片亦未见明显的淋巴细胞浸润和纤维组织增生现象。卵巢移植的大鼠可见卵巢局部见带红色荧光的细胞浓聚现象,除子宫近卵巢端外,其他器官未见有带红色荧光的细胞表达。尾静脉移植组可见带红色荧光细胞均匀分布在卵巢、子宫、肝脏、肾脏皮质,但脑组织未见有红色荧光细胞分布。结论：1人脐带间充质干细胞即使在异种间移植亦不会引起明显的免疫排斥反应,不会影响治疗效果,实验证明人脐带间充质干细胞和大鼠脏器间存在天然的免疫耐受。2卵巢移植组的大鼠仅在卵巢局部看到带红色荧光的人脐带间充质干细胞浓聚现象,部分近卵巢端的子宫部位偶尔可以看到人脐带间充质干细胞,其他器官均未见移植的细胞,而尾静脉移植组大鼠除脑组织外,卵巢、子宫、肝脏、肾脏皮质等器官均可见人脐带间充质干细胞的分布,说明人脐带间充质干细胞可随血流分布到大鼠全身多个脏器并存活,但不能通过正常大鼠的血脑屏障。第四章人脐带间充质干细胞移植改善化疗损伤卵巢功能的实验研究目的：了解人脐带间充质干细胞对大鼠化疗性卵巢早衰的治疗作用,评估两种不同用药途径的区别。方法：1.在体外建立化疗性卵巢早衰的大鼠模型。采用环磷酰胺(cyclophosvnamide, CTX)腹腔注射建模,负荷剂量为50mg/kg,之后按8mg/kg的剂量连续腹腔注射14d。2.PKH26标记人脐带间充质干细胞后,对大鼠进行人脐带间充质干细胞移植。分4组,每组25只wista大鼠,共计100只,经阴道涂片确认有正常性周期后开始实验。(1)对照组不加任何处理。(2)模型组建模后不做其他处理。(3)卵巢注射组,建模完成后,麻醉大鼠后开腹行双侧卵巢注射人脐带间充质干细胞。(4)尾静脉注射组,建模完成后,自尾静脉注射人脐带间充质干细胞。3.观察人脐带间充质干细胞移植后的大鼠卵巢情况。(1)检测大鼠E2、FSH的水平和阴道涂片的改变。在建模前及建模完成后第1d、15d、30d、45d、75d剪尾取血检测E2、FSH的水平,每天8时阴道涂片观测大鼠动情周期的变化。(2)检测大鼠的卵巢的病理改变：建模完成后第1d、15d、30d、45d分批处死大鼠,观察大鼠的病理组织改变,包括卵巢HE染色观察组织形态学变化和卵泡计数。(3)荧光显微镜观察人脐带间充质干细胞存活的情况和细胞位置。(4)观察各组大鼠的生育情况和后代的生长发育情况。移植结束后15d,按照雌雄比例2：1饲养,持续饲养半年,观察大鼠生育能力的恢复情况。生育的幼鼠观察其生长发育的情况。结果：1.大鼠的卵巢内分泌功能：(1)各组大鼠E2水平变化情况：建模前各组大鼠的E2基础浓度对比无统计学差异(P>0.05)。建模完成后1d检测E2浓度：模型组(20.76±2.10)ng/1,卵巢注射组(20.98±1.51)ng/1,尾静脉注射组(20.21±1.53)ng/l,经统计学分析,三组E2水平差异无统计学意义(P>0.05),但远低于对照组(37.62±3.19)ng/1(P<0.01)；建模完成后15d,模型组的E2水平为(19.45±1.41)ng/1,卵巢注射组为(23.82±0.33)ng/1,尾静脉注射组为(23.16±0.60)ng/1。2个移植组的E2水平均高于模型组(P<0.01),但两种治疗途径比较则无差异(P>0.05)。建模完成后15d-75d内,2个移植组的E2水平均高于模型组,比较均有统计学意义(P<0.01),但该2个移植组的E2水平在各时间点比较均无统计学意义(P>0.05)。此外,在整个观察期间,无论是模型组、还是2个移植组的E2水平均有逐渐恢复的趋势,同组间各时间点的E2水平比较均有统计学意义(P<0.01)。(2)各组大鼠FSH变化情况：建模前各组大鼠FSH基础浓度对比无统计学差异(P>0.05)。建模完成后1d时,模型组的FSH水平为(28.60±1.06)mIU/ml,卵巢注射组为(28.75±0.99)mIU/ml,尾静脉注射组为(29.06±1.47)mIU/ml,3组无统计学差异(P>0.05),但远高于对照组的(15.19±0.70)mIU/ml(P<0.01).建模完成后30d,模型组FSH水平为(25.78±0.45)m1U/ml,卵巢注射组为(23.17±0.90)m1U/ml,尾静脉注射组为(25.84±0.52)m1U/ml,卵巢注射组与模型组比较差异有显著性(P<0.05),但尾静脉注射组与模型组比较差异无显著性(P>0.05)。建模完成后75d,模型组FSH水平为(24.73±0.97)mIU/ml,卵巢注射组为(21.42±1.25)mIU/ml,尾静脉注射组为(21.37±1.40)mIU/ml,经统计学分析,三组比较差异有显著性(P<0.05),2个移植组比较差异无显著性(P<0.05)。此外,在整个观察期间,模型组、卵巢注射组,尾静脉注射组的FSH水平均有逐渐恢复的趋势,同组间各时间点的FSH水平比较均有统计学意义(P<0.01)。(3)各组大鼠动情周期的变化：对照组大鼠阴道脱落细胞涂片可见正常的动情周期,而模型组及2个移植组大鼠在注射CTX期间即可见动情周期紊乱、动情期缩短甚至消失,出现持续的动情间期。CTX注射结束后3个月,模型组大鼠的动情周期仍未恢复,2个移植组有25%的大鼠在建模完成后35d-75d恢复正常的动情周期。2.各组大鼠卵巢病理结果：(1)各组大鼠的卵巢大体外观比较：对照组大鼠卵巢外观正常,建模后的大鼠卵巢明显缩小,表面半透明或透明的隆起减少,部分卵巢局部充血。建模完成后1d、15d、30d、45d,2个移植组大鼠的卵巢外观与模型组相比未见明显改变。(2)各组大鼠卵泡计数比较：建模完成后1d,与对照组相比,另外3组大鼠的始基卵泡、初级卵泡数目无显著性差异(P>0.05),但次级卵泡、窦状卵泡差异显著(P<0.05)。建模完成后30d、45d,2个移植组的始基卵泡、初级卵泡及次级卵泡数目高于模型组,低于对照组,比较均有显著性差异(P<0.05)但2个移植组间上述卵泡数目比较均无显著性差异(P>0.05)。建模完成后15d,,卵巢注射组的窦状卵泡数目高于尾静脉注射组,比较有显著性差异(P<0.05)建模完成后30d及45d,2个移植组窦状卵泡数目相比差异无显著性(P<0.05)。此外,在整个观察期间,模型组、卵巢注射组与尾静脉注射组大鼠各时间点的各期卵泡数目对比差异均有显著性(P<0.05),均随着时间的延长而减少,低于对照组水平(P<0.05)。3.各组大鼠生育能力情况：对照组大鼠生育能力正常,每次生育幼鼠8只-12只,卵巢移植组大鼠在移植后64d有1只大鼠生育4只幼鼠,尾静脉移植组大鼠在移植后75d有1只大鼠生育5只幼鼠。此外,移植组生育的幼鼠与对照组相比,无明显差异,性成熟的时间正常。结论：1.人脐带间充质干细胞可以在CTX损伤的大鼠卵巢中存活,迁移,能部分改善建模后大鼠的性激素水平,减轻CTX对卵泡的损伤,卵巢注射组和尾静脉注射组部分大鼠能生育幼鼠,其后代生长发育良好。2.对于两种用药途径,卵巢注射组大鼠的FSH恢复较快,生育幼仔最早,但是,在实验观察的后期,两种用药途径的内分泌功能都达到均衡。由于静脉注射更为微创,对病人的损伤更少,能多次进行注射,提高体内的脐带间充质干细胞的浓度,也许能达到更好的治疗效应,有望成为代替卵巢注射的新的治疗方式。