【摘 要】
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目的:观察长链非编码RNA（Long non-coding RNAs,LncRNAs）lncRNA ENSMUST00000136131在缺氧复氧（Hypoxia/Reoxygenation,H/R）损伤肾小管上皮细胞中的表达情况及其与细胞凋亡的关系,并探索其下游mirco RNA及靶基因调控肾小管上皮细胞凋亡的分子机制。方法:利用抗霉素A和钙离子载体诱导ATP耗竭,构建小鼠肾近端小管细胞（Bos
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目的:观察长链非编码RNA（Long non-coding RNAs,LncRNAs）lncRNA ENSMUST00000136131在缺氧复氧（Hypoxia/Reoxygenation,H/R）损伤肾小管上皮细胞中的表达情况及其与细胞凋亡的关系,并探索其下游mirco RNA及靶基因调控肾小管上皮细胞凋亡的分子机制。方法:利用抗霉素A和钙离子载体诱导ATP耗竭,构建小鼠肾近端小管细胞（Boston University mouse normal tube cells,BT细胞）H/R模型,通过实时q PCR检测H/R不同时间点lncRNA ENSMUST00000136131的表达水平。敲低或过表达lncRNA ENSMUST00000136131,检测其对H/R损伤后BT细胞凋亡指标的影响。通过生物信息学分析筛选lncRNA ENSMUST00000136131的下游靶mirco RNA,双荧光素酶报告分析及原位杂交（FISH）方法,确定lncRNA ENSMUST00000136131对micro RNA的直接调控作用,并沉默或过表达micro RNA,验证lncRNA ENSMUST00000136131通过micro RNA调控肾小管上皮细胞凋亡。通过mi RDB数据库分析,筛选micro RNA下游靶基因,双荧光素酶报告分析验证其与micro RNA的直接结合,敲低或过表达下游靶基因,验证micro RNA与下游靶基因以及lncRNA ENSMUST00000136131与mi R-378a-3p/Rab10之间的关系,并观察该信号轴在H/R模型肾小管上皮细胞凋亡中的调控作用。结果:lncRNA ENSMUST00000136131在缺氧复氧肾小管上皮细胞中表达上调。敲低lncRNA ENSMUST00000136131显著增加肾小管上皮细胞凋亡相关蛋白的表达及细胞凋亡率,过表达lncRNA ENSMUST00000136131则可抑制H/R损伤诱导的细胞凋亡率和凋亡相关蛋白的表达。生物信息学预测、荧光素酶测定和荧光原位杂交（FISH）的结果表明,lncRNA ENSMUST00000136131直接与mi R-378a-3p结合。敲低lncRNA ENSMUST00000136131增加mi R-378a-3p的基础表达和H/R诱导的表达水平,过表达lncRNA ENSMUST00000136131则降低mi R-378a-3p的表达。转染mi R-378a-3p模拟物可促进H/R诱导的BT细胞凋亡率,增加细胞凋亡相关蛋白cleved--caspase3的表达,表明mi R-378a-3p介导H/R诱导的BT细胞凋亡。mi RDB预测mi R-378a-3p的下游靶基因为Rab10,通过荧光素酶分析证实mi R-378a-3p可与Rab10直接结合,转染mi R-378a-3p模拟物显著抑制H/R诱导的Rab10的RNA和蛋白表达水平。Rab10的RNA和蛋白水平在H/R损伤BT细胞中表达均增加,以缺氧2小时复氧2小时增加最显著,敲低Rab10后H/R诱导的细胞凋亡率和凋亡相关蛋白表达水平均显著增加,过表达Rab10则降低H/R诱导的细胞凋亡,说明Rab10作为mi R-378a-3p的直接靶基因,参与H/R损伤肾小管上皮细胞凋亡的调控。BT细胞转染lncRNA ENSMUST00000136131的si RNA和mi R-378a-3p抑制剂,然后给予H/R处理。结果显示,敲低lncRNA ENSMUST00000136131可增加BT细胞凋亡率及cleved-caspase3蛋白表达水平,降低Rab10的蛋白表达,上述效应均可被mi R-378a-3p抑制剂逆转。结论:我们的结果表明lncRNA ENSMUST00000136131可通过靶向mi R-378a-3p/Rab10轴抑制H/R诱导的肾小管上皮细胞凋亡,为AKI的发病机制提供了新的认识和可能的治疗新靶点。
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