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前言:卵巢癌的病死率在妇科恶性肿瘤中居首位,目前其发生机理尚不清楚。近年来,糖复合物与肿瘤的关系受到广泛关注。糖复合物是细胞膜的重要组成部分,参与信号转导、分子粘附等作用,与细胞生长、凋亡、运动、分化等生命过程密切相关。细胞癌变后细胞膜上的糖复合物,特别是其糖链部分发生结构和量的变化。卵巢癌主要表现为Ⅱ型糖链的改变,如Lewisy抗原。研究表明75%的上皮性卵巢癌出现Lewisy不同程度的过量表达,且增高的患者预后不良。
Lewis抗原是肿瘤相关抗原,肿瘤标记物CA125和MUC-1的分子结构中均含有Lewisy结构。Lewis抗原是细胞表面糖脂或糖蛋白上的糖类抗原,其最小组成单位是三糖,即半乳糖(Gal)、N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)和岩藻糖(Fuc),它们连接成Galβ1,3(Fucα1,4)GlcNAc(即Lewis a)或Galβ1,4(Fucα1,3)GlcNAc(即Lewis x)。如上述两种Lewis抗原中半乳糖的外侧再接上另一个Fuca1,2,即分别为Lewis b或Lewisy。Lewis抗原合成的关键酶是岩藻糖转移酶(fucosyltransferase,FucT),催化GDP-Fuc的Fuc转移至糖链中N-乙酰氨基乳糖残基的N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)上,并以α岩藻糖键相连接,其底物主要是糖蛋白的O-糖链、N-糖链、乳糖系或新乳糖系的糖脂。α岩藻糖转移酶家族目前发现有9型,其中α1,2-岩藻糖转移酶是合成Lewisy抗原的关键限速酶。
我们在前期工作中利用基因转染技术将人α1,2-岩藻糖转移酶(α1,2-fucosyltransferase,α1,2-FT)基因转入卵巢癌细胞系RMG-1,建立了Lewisy稳定高表达卵巢癌细胞系RMG-1-hFUT,发现基因转染后RMG-1-hFUT细胞恶性行为增强。我们推测Lewisy可能作为粘附分子的重要结构参与细胞内信号转导,进而影响卵巢癌细胞的生物学行为。本研究在前期工作的基础上,利用已经建立的Lewisy稳定高表达细胞,探讨Lewisy与整合素α5β1的结构关系,及对其介导的卵巢癌细胞粘附、转移和耐药的影响,为研究卵巢癌的发生发展机制奠定基础,为卵巢癌的早期诊断及靶器官治疗提供理论依据。
方法:
论文一:免疫细胞化学染色法检测基因转染前后细胞中Lewisy抗原和整合素α5/β1的表达,并采用抗体进行阻断,再检测其表达的变化;免疫沉淀检测Lewisy与整合素α5/β1的关系。
论文二:倒置显微镜观察细胞在FN上的形态及铺展情况;Busk方法测定细胞粘附能力;划痕实验检测细胞迁移能力;细胞体外侵袭实验检测细胞侵袭能力;ELISA、Western blot和实时RT-PCR方法检测基因转染前后细胞中TIMP-1、TIMP-2,MMP-2、MMP-9蛋白和mRNA的表达;采用抗体阻断后再检测各组细胞粘附转移情况。
论文三:建立FN介导的细胞粘附模型;MTT检测细胞生长情况;FCM、荧光染色法和透射电镜检测各组细胞凋亡情况;免疫细胞化学、Western blot和实时PCR检测各组细胞Bcl-2、Bcl-XL、FAK和p-FAK蛋白和基因的表达。采用不同抗体或抑制剂处理各组细胞再检测细胞凋亡和相关分子表达情况。
结果:
论文一:RMG-1-hFUT细胞中Lewisy抗原、整合素α5/β1的表达较RMG-1细胞增高,抗整合素α5、β1抗体阻断后,Lewisy表达下降;抗Lewisy抗体阻断后,整合素α5和β1的表达下降。免疫沉淀结果显示整合素α5和β1上有Lewisy,且RMG-1-hFUT中整合素α5和β1上总Lewisy的表达均较RMG-1增高。
论文二:RMG-1-hFUT细胞铺展、粘附和转移能力明显高于RMG-1,抗Lewisy抗体处理后下降。RMG-1-hFUT细胞TIMP-1和TIMP-2在基因和蛋白水平的表达均较RMG-1低,而MMP-2和MMP-9的表达增高,抗Lewisy抗体阻断后,TIMP-1/2蛋白表达升高,而MMP-2/9下降。
论文三:各组细胞的生长抑制率随着卡铂浓度的增加而升高,IC50由低到高依次为RMG-1组、FN-RMG-1组、RMG-1-hFUT组、FN-RMG-1-hFUT组。不同抗体或抑制剂处理后,各组IC50不同程度下降,其中抗Lewisy抗体最明显。卡铂处理前,RMG-1-hFUT组中Bc1-2的表达较RMG-1组低、Bcl-XL和p-FAK较RMG-1组高、FAK无明显差异;与FN粘附后,Bcl-2、Bcl-XL、FAK和p-FAK表达均增高,且FN-RMG-1-hFUT组高于FN-RMG-1组。卡铂处理后,各组Bcl-2、Bcl-XL、FAK和p-FAK表达进一步增强,抗Lewisy抗体阻断后,其表达下降。
结论:
论文一:Lewisy是整合素α5β1结构的一部分,α1,2-FT基因转染使细胞整合素α5β1表达增加,且整合素α5β1亚基上Lewisy的表达也增加。
论文二:Lewisy结构增加整合素α5β1介导的细胞粘附、侵袭及转移能力,Lewisy抗原下调TIMP-1和TIMP-2,上调MMP-2和MMP-9可能是增加整合素α5β1介导的细胞粘附、侵袭及转移能力的机制之一。
论文三:Lewisy通过调控FAK信号转导通路,影响细胞粘附和凋亡相关蛋白的表达可能是整合素α5β1介导的卵巢癌细胞粘附耐药的主要原因之一。