论文部分内容阅读
神经干细胞（neural stem cells，NSCs)是存在于发育中个体和成年个体中枢神经系统中一类具有自我更新和多向分化潜能的细胞，可以通过分裂进行自我更新，或向神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞分化。NSCs的“增殖”和“多向分化”潜能成为其用于治疗神经系统疾病的基础，目前NSCs移植替代治疗已被广泛应用于神经退行性疾病如帕金森病（Parkinson’s disease，PD)等的治疗。移植的NSCs在宿主内可增殖、多向分化和迀移，补充外源细胞，并引起功能恢复。但移植的NSCs的增殖和分化受到来自宿主体内多种因素的影响，因而了解调控NSCs存活和分化等行为的机制，对于NSCs移植治疗神经系统疾病的应用至关重要。Ghrelin作为生长激素受体（growth hormone secretagog receptor，GHS-R)内源性配体，具有神经保护和促进神经再生等非代谢性调节功能。研究发现ghrelin既可促进多巴胺（dopamin，DA)能神经元的存活又能调节其电生理活动，但ghrelin对 D A能神经元主要来源的中脑NSCs的增殖和分化的作用未见报道。本实验应用原代细胞培养技术培养中脑NSCs;流式细胞术检测细胞周期中S期细胞比例(S-phase fraction，SPF)和增殖指数（proliferation index，PI)，观察 ghrelin对中脑NSCs增殖的影响；细胞活性检测试剂盒（cell counting kit-8，CCK-8)检测培养基光密度（optical density，OD)值，观察ghrelin对中脑NSCs细胞活力的影响；免疫焚光染色和Western blots检测P-tubulin III、酪氨酸轻化酶（tyrosine hydroxylase，TH)、胆碱乙酰转移酶（choline acetyltransferase，ChAT)、谷氨酸脱羧酶67(glutamic acid decarboxylase67，GAD67)、胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP)和 NG2蛋白聚糖（Neuronal Glial Antigen2，NG2)的表达，从而观察ghrelin对中脑NSCs向神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞分化的影响。 本研究主要内容包括：⑴中脑NSCs培养3d后可增殖成直径为50-70μm的神经球，7d后可增殖成直径为200-300μm的神经球，神经球为nestin和Ki67免疫双标阳性。CCK-8实验显示，随着培养时间延长，OD值逐渐增加，第5d达到平台期。中脑NSCs诱导分化7d，可见P-tubulin III阳性的神经元，GFAP阳性的星形胶质细胞以及NG2阳性的少突胶质细胞。⑵Ghrelin受体免疫染色结果显示，体外培养的中脑NSCs细胞膜上有GHS-R1a受体的表达。⑶中脑NSCs经10-9?10-6 mol/L的ghrelin处理24 hrs，CCK-8检测培养基的OD值显著增加（0.121±0.004，0.109±0.017，0.111±0.015，0.107±0.019)，与对照组(0.089±0.01)相比，差别有统计学意义（P<0.05)，表明细胞活力显著提高。而使用GHS-R1a阻断剂[D-Lys3]-GHRP-6(10_4mol/L)预处理细胞30min后，可阻断ghrelin(10-8和10-7mol/L)对细胞活力的影响（P<0.05)。⑷中脑NSCs正常培养24hrs后，经ghrelin连续处理2d，与对照组(74.02±4.45μm)相比，10-8?10-6mol/L的ghrelin可使神经球的直径增加（87.82±5.74μm，89.25±4.26μm，87.4牡7.43μm),差别有高度统计学意义(P<0.01)，而10-10?10-9mol/L浓度的ghrelin对神经球直径无影响。流式细胞仪检测细胞周期结果显示，与对照组(16.68±2.03％)相比，10-7和10-6mol/L浓度的ghrelin可以使SPF值显著提高(16.8±2.06%,19.85±1.67%)，差别有统计学意义（P<0.05)，而10-10?10-8mol/L浓度的ghrelin对SPF值无影响（14±1.63%，14.43±1.52%，15.15±1.56%)(p>0.05)。10-8?10-6mol/L浓度的ghrelin可使PI值显著提高（23.95±2.49%，24.1±2.33%，26.28±2.50%)，与对照组(13±1.23%)相比，差别有统计学意义（P<0.05)。而10-10和10-9mol/L浓度的ghrelin对其无显著影响（P>0.05)。⑸Ghrelin连续处理分化状态的中脑NSCs7d，10-8?10-6mol/L的ghrelin可增加P-tubulin皿阳性细胞的数量（21.09±2.46%，23.05±1.87%，28.8±3.05%)，与对照组（13.6±3.37%)相比，差别有统计学意义(p<0.05)，同时western blot结果显示P-tubulin皿蛋白的表达量也显著增加（P<0.05)。10-10和10-9mol/L的ghrelin对P-tubulin H阳性的神经元比例无显著影响（P>0.05)。10-8~10-6mol/L的ghrelin可促进TH蛋白的表达（P<0.05)，10-10和10-9mol/L的ghrelin对TH的表达无显著影响(p>0.05)。但10-8?10-6mol/L的ghrelin可显著抑制ChAT蛋白的表达（P<0.05);而10-10?10-6mol/L的ghrelin对GAD67蛋白的表达无显著影响（P>0.05)。⑹Ghrelin连续处理分化状态的中脑NSCs7d，与对照组（73.4±10.86%)相比，10-7和10-6mol/L的ghrelin能够减少GFAP阳性细胞的数量（49.96±5.85%，44.4±6.69%)，抑制GFAP蛋白的表达（P<0.05)，而10-10?10-8mol/L的ghrelin对GFAP阳性的星形胶质细胞的表达无显著影响（68.2牡7.57%，70.65±10.24%，65.13±8.51%)(P>0.05)。10-8?10-6 mol/L的ghrelin明显促进NG2阳性细胞的数量(5.35±0.55%，7.02±0.81%，9.09±1.1%)，促进NG2蛋白的表达(p<0.05)，而10-10和10-9mol/L的ghrelin对NG2阳性的少突胶质细胞的分化无显著影响(2.44±0.37%，2.71±0.5%)(p>0.05)。