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第一部分文献研究目前,糖尿病已经成为继肿瘤和心血管疾病之后第三位严重危害人类健康的慢性病,其发病率逐年上升,估计到2030年全球将有近5亿人患糖尿病。2008年的调查结果显示,我国在20岁以上的成人中,每四个成年人中就有一个高血糖状态者。迄今为止,人类对于糖尿病的还没有找到有效的根治方法,这也就意味着糖尿病患者需要终身治疗。糖尿病的治疗手段主要围绕重点解决胰岛素抵抗和胰岛素缺乏两方面来实行,可以分为胰岛素治疗和非胰岛素治疗。胰岛素治疗主要适用于1型糖尿病病人和部分口服药失效或有口服药禁忌症的2型糖尿病病人。口服降糖药物可以分为促胰岛素分泌剂(包括磺脲类、格列奈类)和非促胰岛素分泌剂(包括双胍类、噻唑烷二酮类、α-糖苷酶抑制剂)。磺脲类药物、格列奈类药物直接刺激胰岛素分泌;非促泌剂包括噻唑烷二酮类药物,双胍类药物及α-糖苷酶抑制剂。近年来, GLP-1受体激动剂和二肽基肽酶-IV抑制剂(DPP-IV抑制剂)的发现又为糖尿病治疗提供了新的手段。糖尿病,中医又称之为消渴病,此外还有消瘅、肺消、膈消、消中等称谓。祖国医学对消渴病的认识由来已久,最早可以追溯到先秦时期,东汉时期,张仲景、隋代巢元方、唐代王焘、明代张景岳等历史上的有名医家均对该病作出了详细而深入的研究和解释。现代医家对消渴病研究也相当丰富,并进行了大量的实验研究,取得了许多的研究成果。虽然目前针对糖尿病的治疗方法比较多,但仍未能使患者摆脱终身治疗困境,同时,其治疗费用高昂,根据世界卫生组织估计2005到2015年间中国由于糖尿病及相关心血管疾病导致的经济损失达5577亿美元。中药具有廉价、多靶点等优势,可以从多个方面、全方位的对糖尿病给予治疗,具有很大的发展空间。降糖三黄片2号是我科名老中医熊曼琪教授根据《伤寒论》桃核承气汤加减化裁而来的,从上个世纪80年代开始进行了大量的临床和实验研究,并在我院临床广泛应用,取得了良好的疗效,其作用机理还有待进一步挖掘,以扩大经方在临床的适应症。第二部分实验研究目的:通过研究降糖三黄片2号含药血清对体外培养大鼠胰岛细胞凋亡的影响,探讨降糖三黄片2号治疗和改善胰岛细胞凋亡的作用靶点与作用机理,从信号传导通路机制角度,科学的揭示降糖三黄片2号的作用机制。通过研究临床患者使用降糖三黄片2号后凋亡相关基因和通路的表达,证实降糖三黄片2号在临床上具有改善患者胰岛细胞凋亡的作用。方法:实验部分:取3周龄大SPF级Wistar大鼠,雄性,5只,断颈处死,取胰腺提取胰岛细胞培养。取成年新西兰兔,雄性4只,随机分为空白对照组、降糖三黄片2号组,共2组,普通饲料喂养1周后开始灌胃。空白组予蒸馏水灌胃;降糖三黄片2号组给予(2g/Kg)三黄降糖片2号灌胃。经过7天灌胃后,乙醚麻醉,腹主动脉取血,离心(3000转/分)5分钟,取上清液冻存备用。1流式细胞检测分组:将细胞用普通培养液培养3天后,随机分为高糖培养液组、高糖培养液+降糖三黄片2号含药血清组、普通培养液组培养72小时后检测。2ELISA检测分组:将细胞用普通培养液培养3天后,随机分为普通组和高糖组两个大组。普通组设3个亚组:普通培养液组、普通培养液+降糖三黄片2号含药血清组、普通培养液+不含药血清组;高糖组设3个亚组:高糖培养液组、高糖培养液+降糖三黄片2号含药血清组、高糖培养液+不含药血清组培养72小时,取细胞裂解液待检测。利用Annexin V-FITC联合PI双标法进行流式细胞术定量检测其凋亡情况。采用ELISA检测IKBKB、NFKBIA、NF-kB、BAX检测NF-kB通路相关因子表达情况。观察数据以均数±标准差(X±S)表示,计数资料采用X2检验,计量资料采用方差分析,数据处理使用SPSS13.0软件包,P<0.05认为有统计学意义。临床部分:选择广州中医药大学第一附属医院2011年1月至2011年12月的住院病人48例,均为符合2型糖尿病诊断标准的2型糖尿病病人。将入选病人随机分为治疗组(24例)和对照组(24例)。平衡入选患者基线特征,基础治疗均使用胰岛素治疗,治疗组予口服降糖三黄片2号,8粒/tid;对照组给予基础治疗,治疗4周后,清晨空腹抽血待检测,采用ELISA检测IKBKB、NFKBIA、NF-kB、BAX表达情况。统计学处理以均数±标准差(X±S)表示,计数资料采用X2检验,数据处理使用SPSS13.0软件包,P<0.05认为有统计学意义。结果:实验部分:以流式细胞仪检测细胞凋亡情况发现,普通培养液组细胞凋亡率为5.05±0.2%,高糖培养液组细胞凋亡率为15.33±1.30%,高糖培养液+降糖三黄片2号含药血清组细胞凋亡率为10.43±0.57%,经统计学检验P<0.05,具有的统计学意义,证明高糖培养液可以诱发胰岛细胞凋亡,而降糖三黄片含药血清可以抑制高糖诱导的胰岛细胞凋亡。细胞培养检测结果提示,高糖培养液组的IKBKB表达明显高于高糖+降糖三黄片含药血清组,经统计学检验P<0.01,与普通培养液组比较,高糖加入降糖三黄片含药血清组的IKBKB表达与其无明显差别,在NFKBIA测定中,各组间NFKBIA的浓度未见明显区别,高糖组的NF-kB表达明显高于加入降糖三黄片的两组,经统计学检验P<0.05,同时也高于普通培养液组,同时加入降糖三黄片含药血清组促凋亡基因BAX的表达也低于其他各组,经统计学检验P<0.01,具有明显的统计学意义,证明降糖三黄片有通过降低促凋亡基因表达而抑制凋亡的作用。临床部分:通过检测患者血清中IKBKB、NFKBIA、NF-kB、BAX含量的到与实验研究相同的结论,治疗组与对照组之间IKBKB浓度有区别,经统计学检验P<0.05,治疗组与对照组之间NFKBIA浓度有区别,经统计学检验P<0.05,治疗组与对照组之间NF-kB浓度有显著差异,经统计学检验P<0.01,治疗组与对照组之间BAX浓度有显著差异,经统计学检验P<0.01,具有明显的统计学意义,证明降糖三黄片在临床应用中同样具有明显的抑制凋亡作用。结论:降糖三黄片2号具有明显的抑制和延缓胰岛细胞凋亡的作用,其作用机制可能与调节Bcl-2家族蛋白表达有关,同时该药可以明显降低NF-kB水平,从而提示该药有抑制凋亡的作用。