脂肪无细胞提取物不同温度保存对人皮肤成纤维细胞增殖和迁移的影响

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目的:明确不同温度保存脂肪无细胞提取物(Fat Acellular Extract,FAE)对人皮肤成纤维细胞(Human Skin Fibroblast,HSF)增殖和迁移能力的影响,为临床应用提供参考。方法:使用大侧孔(2.0mm×7.0mm)吸脂针获取脂肪颗粒,1200g离心3分钟去除油层和肿胀液,通过内径2.0mm的Luer-Lock连接器机械乳化30次,1200g离心5分钟丢弃油层、脂肪层和细胞碎片,0.22μm针式过滤器过滤得到FAE。使用BCA法测定总蛋白浓度。分装后分别在4℃、-20℃和-80℃无菌保存30天。常规培养HSF至第3-4代对数生长期。每孔分别加入新鲜FAE(Fresh)和静置复温至室温的4℃(4℃组)、-20℃(-20℃组)、-80℃(-80℃组)保存的FAE各20μL,以无菌PBS溶液20μL为对照(空白对照组),常规培养24小时,CCK-8法检测细胞增殖活力,流式细胞术和Flow Jo软件分析细胞周期变化,划痕实验和Image J软件测量评估细胞迁移能力。蛋白含量吸光度值、细胞增殖率、细胞迁移率和周期百分比以平均值±标准差表示。采用SPSS 19.0软件进行统计分析。各组数据均进行正态性检验,数据符合正态分布的,组间比较采用单因素方差分析,数据不符合正态分布的,使用Kruskal-Wallis秩和检验;两两比较方差齐采用LSD法进行比较,方差不齐采用Dunnet-T3进行比较。P<0.05表示差异具有统计学意义,P<0.01表示差异显著。结果:1、FAE外观:新鲜制备的FAE在4℃、-20℃、-80℃保存30天后,颜色随着保存温度降低逐渐变浅。2、FAE总蛋白浓度为3.32±0.05mg/m L。3、细胞增殖:4℃、-20℃、-80℃保存30天的和新鲜FAE均可促进HSF增殖(P<0.05),4℃组的促HFS增殖作用比-20℃组和-80℃组更强(P<0.05和P<0.01),而-20℃组和-80℃组的作用相同(P>0.05)。4、细胞周期分析:4℃、-20℃、-80℃保存30天的和新鲜FAE处理HSF24小时,与对照组比较,均减少G0/G1期细胞,S期、增加G2/M期细胞(P<0.05),4℃组的变化比-20℃组和-80℃组更明显(P<0.05),而-20℃组和-80℃组的变化相同(P>0.05)。5、细胞迁移:4℃、-20℃、-80℃保存30天的和新鲜FAE均可促进HSF迁移(P<0.05),4℃组的作用比-20℃组和-80℃组更强(P<0.05),而-20℃组和-80℃组的作用相同(P>0.05)。结论4℃、-20℃、-80℃保存的FAE均可促进细胞增殖和迁移,以4℃保存的作用最为显著。
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