枸杞发酵酒优良酵母的选育及其应用

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枸杞(Lycium barbarum L)属于茄科,在我国新疆、宁夏、甘肃和青海等地均有种植,其富含多种氨基酸、有机酸、粗纤维、粗蛋白等营养成分以及枸杞多糖等多种功能成分。枸杞酒的酿造可解决枸杞深加工问题,促进枸杞产业的发展。目前发酵枸杞酒所用酿酒酵母依赖于葡萄酒酵母或通用型果酒酵母,缺少专用的酿酒酵母导致枸杞酒香气不足以及典型性不突出等问题,限制了枸杞发酵酒行业的发展。因此,选育枸杞酒专用酿造菌株是提升枸杞酒品质的关键。本文从枸杞表面及果园土壤中,筛选分离出枸杞酒酿造微生物,利用常温室压等离子体(atmospheric and room temperature plasma,ARTP)诱变技术和高通量筛选(high throughput screening,HTS)相结合的方法选育产香优良、适合枸杞酒发酵的酿酒酵母;同时筛选出产β-葡萄糖苷酶的非酿酒酵母来提高枸杞酒中的风味物质;进一步优化了枸杞酒的发酵工艺条件,明确了枸杞酒的主要风味物质。论文研究内容及结果如下:(1)采用气相色谱-质谱联用技术对两种市售发酵型枸杞酒(“健康快车”、“金色传杞”)的风味物质进行定性测定,明确了枸杞酒中主要的风味物质,并对主要风味物质进行定量测定,结合香气活力值(OAV)确定了两种市售发酵型枸杞酒的7种关键呈香物质,7种物质及其OAV值分别为乙酸异戊酯(3.4~4.4)、丁酸乙酯(2.9~3.6)、乙酸乙酯(3.2~5.6)、己酸乙酯(2.1~4.8)、异戊醇(4.0~5.5)、丙醇(5.5~5.8)、苯乙醇(1.8~2.6)。(2)从宁杞5号枸杞果和果园土壤中筛选出1株性能良好的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)M-23,进一步通过ARTP诱变技术和HTS相结合的方法,定向筛选出适用于枸杞酒发酵的酿酒酵母M-23-7-14,与出发菌株M-23相比,该菌株发酵的枸杞酒的基础理化指标无明显差异,但关键风味化合物的含量提高了37.0%。对不同枸杞酒的风味物质进行定量分析,其中M-23-7-14发酵枸杞酒中的7种呈香物质的总含量较“健康快车”提高了41.7%,较“金色传杞”提高了29.9%,比安琪酵母SY发酵枸杞酒提高了36.8%。将菌株M-23-7-14经过连续7代培养,在保证酒精度、总糖和总酸一致的前提下,获得的枸杞酒的酒精度和风味物质总含量保持相对稳定水平,该进化菌株具有良好的遗传稳定性。(3)从宁杞5号枸杞果和果园土壤中筛选得到6株产β-葡萄糖苷酶的非酿酒酵母,通过生长曲线测定以及酒精、渗透压耐受性试验对其生理特性进行研究,优选异常维克汉姆酵母(Wickerhamomyces anomalus)Y11与酿酒酵母M-23-7-14混合发酵枸杞酒。结果表明,当酵母M-23-7-14与Y11以10:1比例混合,且先接种酵母Y11,间隔12 h接种酵母M-23-7-14时,体系发酵性能最优。混菌发酵相较于纯种发酵,风味物质的总含量提高了21.7%,其中酯类和酸类物质的含量比纯种发酵提高了85.8%和111.3%。(4)以酵母M-23-7-14和Y11作为枸杞酒发酵菌株,先接种酵母Y11(1×10~6CFU·m L-1)间隔12 h接种酵母M-23-7-14(1×10~7 CFU·m L-1),利用单因素实验对枸杞酒发酵工艺进行优化,得到最佳发酵工艺:初始糖度为200 g·L-1,发酵温度为16℃,料液比为1:10。关键风味物质的定量测定结果表明,工艺优化后混菌发酵枸杞酒中关键风味化合物的总量为436.66 mg·L-1,相较于优化前的混菌发酵提高了17.6%。用20 L发酵罐进行枸杞酒酿造的放大实验,结果表明以菌株M-23-7-14和Y11混合发酵枸杞酒的理化指标均正常,关键风味物质的含量与三角瓶发酵基本一致,说明本文选育的酵母菌株具有应用于工业化酿造枸杞酒的可行性。
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