骨化三醇治疗实验性自身免疫性脑脊髓炎的实验研究

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目的:通过体内外实验,探讨骨化三醇(Calcitriol)对实验性自身免疫性脑脊髓炎(Experimental Autoimmune Encephalomyelitis,EAE)治疗效果和相关的作用机制。   方法:1、用MOG33-35(Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein)特异性多肽与完全弗氏佐剂(Complete Freunds’Adjuvant,CFA)的混合乳剂免疫健康C57BL/6雌性小鼠,于免疫当天和第2天用百日咳毒素(Pertussis Toxin,PT)尾静脉注射加强免疫效果,建立EAE实验性动物模型。2、从免疫当天起进行骨化三醇腹腔注射100ng隔日治疗,观察和分析EAE组与治疗组小鼠之间临床表现和评分差异。3、分别于免疫后第7天、15天和21天取各组小鼠的脊髓制做石蜡切片,HE染色观察炎细胞浸润情况,LFB染色观察脱髓鞘情况,同时分离淋巴细胞采用流式细胞术检测各组淋巴细胞中Th1(CD4+-IFN-γ+)、+Th17(CD4+-IL-17)Th2(CD4+-IL-4+)和Treg(CD4+-Foxp3+)细胞的分布情况。4、体外淋巴细胞增殖实验检测骨化三醇对T淋巴细胞活性的影响及摸索药物适宜浓度,在此基础上用流式细胞术检测骨化三醇体外干预对Th1和Th17细胞亚型分布的影响。   结果:1、成功建立EAE动物模型;2、治疗组症状出现迟且临床评分分数较低。自第15天起,治疗组与EAE组小鼠平均临床评分具有显著性差异(P<0.05);3、脊髓HE结果显示,CFA组小鼠脊髓白质处没有炎症浸润;EAE组小鼠于第15天和第21天脊髓白质可见明显炎症浸润,且第15天的炎症浸润明显比第21天时严重;治疗组小鼠在相同时间点,脊髓白质处炎症浸润较EAE组明显减轻。LFB染色结果显示,CFA组小鼠脊髓白质处没有脱髓鞘病变;EAE组小鼠于第15天和第21天脊髓白质可见明显脱髓鞘斑块,治疗组小鼠,在相同时间点,脊髓白质处基本没有脱髓鞘病变;4、体内流式细胞术检测结果显示,同CFA组相比,EAE组Th1和Th17细胞表达增加,差异显著;治疗组同EAE组相比,这两种细胞表达下降,Th2和Treg细胞表达增加,差异明显,具有统计学意义;5、淋巴细胞增殖实验显示,体外中等浓度(10nmol/L)的骨化三醇具有较好干预的效果,能够有效抑制MOG35-55特异性淋巴细胞的增殖能力,体外流式细胞术检测此干预浓度能有效降低Th1和Th17细胞的产生。   结论:1、骨化三醇可以延缓EAE发病时间,减轻临床症状与病理变化,对EAE小鼠有一定的治疗作用;2、骨化三醇通过上调抑炎性细胞Th2和Treg,下调促炎性细胞Th1和Th17实现对小鼠EAE的预防和治疗;3、骨化三醇能够抑制MOG35-55特异性淋巴细胞增殖,有一定免疫调节作用。
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