背景及目的梗阻性肾病（Obstructive Nephropathy,ON）是指由于尿路梗阻导致尿流排出障碍,引起肾盂和肾小管内压力增高,最终导致肾实质和肾功能损害的疾病。ON是导致慢性肾病（Chronic Kidney Disease,CKD）的主要原因。此外,ON的隐匿性使其诊断困难,患者常得不到及时的治疗从而会加剧CKD的进展。ON也是急性肾损伤（Acute Kidney Injury,AKI）发生的常见原因,约占所有AKI病例的17%,而AKI会增加发生CKD发生的风险。肾脏纤维化在ON引起CKD过程中扮演着关键角色,是CKD向终末期肾病（End Stage Renal Disease,ESRD）发展的最终途径。因此,抑制纤维化或许可以延缓或预防ESRD。肾脏纤维化目前尚无理想的治疗方法,究其原因可能与肾脏纤维化的机理尚无完全搞清楚有关。ON的纤维化特征是肾小球和肾小管间质中上皮细胞丢失,细胞外基质蛋白（Extracellular Matrix,ECM）的沉积增加,这些蛋白会逐渐取代肾脏正常的组织结构,并阻止肾脏细胞的正常功能。目前有关驱动肾纤维化的细胞机制仍不完全清楚。文献报道炎性因子和炎症细胞是导致纤维化的主要原因,但炎症影响纤维生成的机制仍需要进一步探讨,理解其中的关系可能是制定能够阻止纤维化进展治疗策略的关键所在。大量研究表明ON的炎症特征是过度的固有和获得性免疫反应以及炎症细胞的浸润和细胞因子的释放。通常,炎症是对机体潜在有害的内源性或外源性损伤的保护性反应,旨在消除病变细胞威胁并通过纤维化促进组织修复。然而,持续性炎症会对机体组织造成损害,并且如果不及时纠正,会造成持续的胶原蛋白生成,进而导致组织器官纤维化。因此,在ON的治疗中,靶向炎症因子是一种合理的策略。不幸的是,ON长期炎症反应和纤维化的潜在病理生理学机制,包括免疫系统在其中扮演的角色,目前知之甚少。单侧输尿管完全梗阻（Complete Unilateral Ureteral Obstruction,CUUO）已成为研究肾纤维化机制以及评估改善慢性肾脏疾病的潜在治疗方法的重要模型。CUUO肾脏的病理特征是肾小管扩张、间质扩张、近端肾小管组织丧失、肾积水、白细胞浸润、肾小管上皮细胞死亡和成纤维细胞增生。啮齿类动物的实验性CUUO被公认为是以一种加速的方式能够模拟人类CKD病理过程。由于氧化应激、RAS系统激活和细胞炎症因子的刺激,核因子-κB（Nuclear factor κB,NF-κB）会转移到细胞核,启动导致炎症和纤维化靶基因的转录。炎症因子的增加还会加速纤维化过程,比如肿瘤坏死因子α（Tumor Necrosis Factor α,TNF α）通过激活NF-κB途径可以刺激成纤维细胞产生转化生长因子β1（Transforming Growth Factor-β1,TGF-β1）,而TGF-β1能够促进纤维化进程。TRIM蛋白是“E3泛素连接酶”中RING家族的成员,其特征是存在三个保守结构域,即RING,B-Box和coiled-coil。最近TRIM蛋白作为“E3泛素连接酶”在调节NF-κB信号通路中起着关键作用的研究引起了世界许多研究者的关注。Mitsugumin 53（MG53）,又称为TRIM72,是一种主要在在骨骼肌和心肌大量表达的TRIM家族蛋白成员,是细胞膜损伤修复不可缺少的一部分。当细胞膜发生损伤时MG53可快速定位到损伤部位,封闭损伤的细胞膜,从而发挥其保护作用,因此MG53也被称为是细胞损伤的分子绷带。肾脏功能紊乱可以分成AKI和CKD,CKD在老年人群中的发病率越来越高,主要原因是老年人群的肾脏对损伤修复能力随着年龄增加而减退,而与此研究有关的动物模型研究较少。有文献报道MG53可以调节TLR/NF-κB信号通路发挥其抗炎作用,进而保护小鼠海马神经元细胞系（HT22细胞系）和小鼠海马神经组织免受脂多糖（Lipopolysaccharides,LPS）诱导的神经毒性。但如果敲除MG53基因,是否会加速肾纤维进程,目前还没有文献报道。巨噬细胞过去通常被认为是促进CUUO肾纤维化的关键因素。然而,最新研究表明浸润性巨噬细胞具有抗纤维化作用,可在与ON引起的进行性肾瘢痕形成过程中保护肾结构。因此,我们构建了一种可以向CUUO小鼠肾脏递送依赖DOX诱导表达并分泌MG53的RAW 264.7单核巨噬细胞,研究过表达MG53是否具有减轻肾纤维化的生物学效应。当组织表达分泌的内源性MG53不能满足损伤修复的要求时,此时给予外源性rhMG53（Recombinant human MG53,rhMG53）就成为一种补充MG53的手段,研究已经证实给予外源性rhMG53,对心脏、骨骼肌、肺、肝脏、脑、肾脏在内的多种器官缺血/再灌注损伤（Ischemia/Reperfusion Injury,IRI）均能起到很好的保护作用,此外也能促进皮肤伤口愈合,减轻疤痕的形成。但是rhMG53能否在CKD过程中发挥其抗炎作用,进而控制肾脏纤维化目前也没有文献报道,而这个问题的研究对于推动rhMG53蛋白的临床转化应用起着重要作用。因此,本研究分为以下四个部分,分别如下:第一部分 CUUO对MG53KO小鼠肾脏纤维化的影响研究目的探讨CUUO对MG53基因敲除（MG53KO）小鼠肾脏炎症发生及纤维化的影响。材料及方法1.选取8-12周MG53 WT（野生型）和MG53KO小鼠各16只,体重（23.5±1.2）g,将WT及MG53KO小鼠各自随机平均分为Sham组（假手术组）及CUUO组,即Sham WT、Sham KO、CUUO WT、CUUO KO,n=8;使用异氟烷（浓度 1.5-2.0%）麻醉小鼠,在腹部中线行开腹术,分离出左侧输尿管,使用5-0外科丝线对左侧输尿管实施双重结扎作为CUUO组,只做腹部切开缝合作为Sham组。分别在术后第1、3、7天后,采用CO2窒息后颈椎脱臼法处死Sham组和CUUO组小鼠,收集双侧肾脏标本。2.采用HE染色评估在术后第1、3、7天时WT和MG53KO小鼠的肾脏形态变化情况,Masson染色比较WT和MG53KO小鼠在1、3、7时肾脏纤维化变化情况;采用免疫组化染色（Immumohistochemical,IHC）及Western Blot检测并比较WT和MG53KO小鼠在第1、3、7天时胶原纤维蛋白、白细胞抗原标志物CD11b及巨噬细胞浸润抗原标志物F4/80和MG53蛋白变化情况。3.统计学方法:所有实验数据采用均数±标准误（x±s）表示,采用SPSS22.0统计学软件进行分析处理数据,两个样本均数比较采用t检验,多样本均数比较采用单因素方差分析法的两两比较,P＜0.05为差异有统计学意义。结果1.在CUUO术后1、3、7天,HE染色显示MG53KO组与WT组的肾脏病变程度随着天数增加而增加,而且在CUUO术后1、3、7天时CUUO MG53KO组与CUUO WT组的肾脏HE染色分别相比,病变程度更重。2.在CUUO术后 1、3、7 天,Masson染色显示CUUO MG53KO组与CUUO WT组的肾脏纤维化程度随着天数增加而增加,而且在CUUO术后1、3、7天时,CUUO MG53KO组与CUUO WT组的肾脏分别相比,纤维化程度更重,分别为（0.85±0.05）vs（0.56±0.03）,（1.84±0.03）vs（0.64±0.02）,（2.72±0.07）vs（0.81±0.04）,P＜0.05,差异有统计学意义。3.在CUUO术后1、3、7天,IHC染色及WB检测显示CUUO MG53KO组与CUUO WT组肾脏的Collagen 1、Collagen 3及FN的表达程度随着天数增加而增加,而且在CUUO术后1、3、7天时CUUO MG53KO组与CUUOWT组分别相比,Collagen 1、Collagen 3 及FN的表达量更高。4.在CUUO术后1、3、7天,IHC染色及WB检测显示CUUO MG53KO组与CUUO WT组肾脏的白细胞抗原标志物CD11b及巨噬细胞浸润抗原标志物F4/80的表达程度随着天数增加而增加,而且在CUUO术后1、3、7天时,CUUO MG53KO组与CUUO WT组分别相比,CD11b及F4/80的表达量更高。5.在CUUO术后1、3、7天,IHC染色及WB检测显示CUUO WT组肾脏中的MG53的表达量随着天数增加而增加,而在CUUO术后1、3、7天时,CUUO MG53KO组均没有检测到MG53的表达。结论在CUUO术后1、3、7天时,与CUUO WT小鼠相比,CUUO加重了MG53KO小鼠的肾脏炎症程度及纤维化进程。第二部分 MG53抑制NF-κB活化的机制研究目的探讨MG53能否调控小鼠肾脏近端肾小管上皮细胞（Proximal Renal Tubule Epithelial Cell,PTEC）NF-κB的活性及其机制。材料及方法1.分别从2-3个月龄的Sham WT和Sham MG53KO肾脏分离小鼠原代PTEC,PTEC在没有血清的培养基中饥饿8个小时后用LPS（Escherichia coli O111:B4,Sigma L2630,美国）处理。收集细胞以备WB检测,培养基离心后移除细胞碎片并将上清冷冻在-80°冰箱中以备ELISA检测,PTEC用4%多聚甲醛固定以备细胞免疫荧光分析。收集不同治疗组动物的血清和小鼠原代PTEC所有组中培养基的上清液,并保存在-80℃。通过ELISA测定并比较Sham WT组及Sham MG53KO组分离的PTEC在LPS刺激6h后释放的IL-6、TNFα、IL-10、IL-1β的细胞因子水平。2.通过免疫荧光染色分析Sham WT及Sham MG53KO组的PTEC在缺氧和对照情况下p65及IκBα在细胞内的位置。3.将PCMS-MG53和带有MYC标签的p65转染HEK293细胞24小时后,然后将转染的细胞在含有蛋白酶体抑制剂MG132的培养基中培养6小时,然后收集细胞进行CO-IP实验。4.将等量（200 ng/孔）的PCMS标签表达MG53的构建体（如上所述）及IκBα启动子质粒共同转染到HEK293FT细胞中。转染后再等18小时,在指定的时间内用20ng/ml的TNFα刺激细胞。5.统计学方法:所有实验数据采用均数±标准误（x±s）表示,采用SPSS22.0统计学软件进行分析处理数据,两个样本均数比较采用t检验,多样本均数比较采用单因素方差分析法的两两比较,P＜0.05为差异有统计学意义。结果1.Western Blot 结果显示与 Sham WT 组及 Sham MG53KO 组相比,Sham WT+LPS及Sham MG53KO+LPS组的p-IκBα/IκBα及p-p65/p65 的比值分别明显升高;相比Sham WT+LPS组,Sham MG53KO组的PTEC在LPS刺激后p-IκBα/IκBα及p-p65/p65的比值明显升高。ELISA结果显示与Sham WT组相比,Sham WT+LPS组明显分泌更多的TNFα、IL-6及IL-1β;相比Sham WT+LPS组分泌TNFα、IL-6及IL-1β炎症因子,Sham MG53KO+PTEC组在LPS刺激后分泌更多的TNFα、IL-6及IL-1β炎症因子。2.免疫荧光结果显示在Sham WT及Sham MG53KO,p-IκBα蛋白荧光强度表达较弱;p65蛋白荧光强度表达也较低,主要在细胞质。在Sham WT+LPS及Sham MG53KO+LPS组,p-IκBα蛋白荧光强度表达表达升高;p65蛋白荧光强度表达也加强,主要在细胞核。在缺氧应激条件下,WT和MG53KO组的p65都能进入PTEC细胞核内,但ShamMG53KO+LPS组的p-p65及p-IκBα蛋白荧光强度更高。3.CO-IP结果显示MG53可以和IκBα直接相互结合。4.“荧光素酶试验”显示在TNF-α刺激4h后,pcms-MG53组的荧光素酶的荧光相对强度,相比空载体组（PCDNA）,MG53明显促进了IκBα启动子的转录活性,P＜0.05,差异有统计学意义。结论MG53能够与IκBα启动子转录区域互相结合,从而促进IκBα的表达。第三部分 构建Tet-On系统调控分泌MG53的巨噬细胞减轻梗阻性纤维化的研究目的构建基于Tet-On系统可调控分泌MG53的巨噬细胞,探讨过表达MG53是否具有改善CUUO小鼠肾纤维化的生物学效应。材料及方法1.将表达tPA的基因序列克隆到MG53cDNA全长序列的前端,然后设计引物应用PCR方法扩增tPA-MG53序列,将PCR产物克隆入经pShuttle-TetON-CMV-GFP修饰过的腺病毒空载体上,这种腺病毒载体上在启动子区域包含四环素响应元件（Tetracycline Response Element,TRE）以产生依赖DOX诱导表达MG53的Ad-tPA-MG53-GFP质粒。然后转化并提取这个质粒。最后使用特定的试剂盒包装、扩增、纯化Ad-tPA-MG53-GFP腺病毒。用Ad-tPA-MG53-GFP及对照组（Ad-tPA-Vector-GFP）腺病毒感染RAW264.7细胞12h后,再经DOX诱导24小时后,用4%多聚甲醛固定细胞进行免疫荧光染色,收集经过腺病毒及对照组腺病毒感染的RAW264.7细胞裂解液及从浓缩培养基中分泌的蛋白进行Western Blot。2.随机选取8-12周MG53KO小鼠24只,体重（20.7±1.9）g,随机将分为4组,每组6只。其中三组进行CUUO术为实验组,实验组中一组术后只给予含DOX饮水,不进行干预治疗,为CUUO none组;其中一组术后经尾静脉注射106个经对照腺病毒感染的RAW264.7细胞,并给予含DOX饮水,为Ad-tPA-GFP组;第三组为术后经尾静脉注射106个经Ad-tPA-MG53-GFP腺病毒感染的RAW264.7细胞,并给予含DOX饮水,为Ad-tPA-MG53-GFP组;Sham组只做腹部切开缝合,并给予含DOX饮水为空白对照组。CUUO组每隔一天给予实验组小鼠注射1次经过Ad-tPA-MG53-GFP腺病毒及Ad-tPA-Vector-GFP对照腺病毒感染12小时的RAW 264.7细胞,总共注射4次;CUUO none和Sham组同时只给予含DOX饮水,术后7天后将全部小鼠处死,收集肾脏组织样本进行Western Blot、Masson及免疫荧光染色等实验。3.统计学方法:所有实验数据采用均数±标准误（x±s）表示,采用SPSS22.0统计学软件进行分析处理数据,两个样本均数比较采用t检验,多样本均数比较采用单因素方差分析法的两两比较,P＜0.05为差异有统计学意义。结果1.用MG53抗体对感染过腺病毒的RAW264.7巨噬细胞进行共聚焦免疫荧光染色,Ad-tPA-Vector-GFP腺病毒感染RAW26.7细胞12小时后,给予DOX诱导培养24小时后,固定细胞进行免疫荧光,结果显示没有红色荧光表达（MG53）的表达;Ad-tPA-MG53-GFP腺病毒感染RAW26.7细胞12小时后,给予DOX诱导培养12小时后,给予DOX诱导培养24小时后有红色荧光表达（MG53）,表明DOX能够诱导Ad-tPA-MG53-GFP-RAW细胞表达MG53。2.Masson染色显示经尾静脉注射Ad-tPA-MG53-GFP-RAW264.7细胞组的小鼠,与经尾静脉注射Ad-tPA-Vector-GFP-RAW264.7细胞组的小鼠及没有进行细胞注射治疗的CUUO小鼠相比,肾脏纤维化面积明显减少,分别为（42.78±5.31）vs（64.67±7.80）、（60.62±8.03）,差异有统计学意义;3.与 Sham 组、CUUO none 组、CUUO Ad-Vector 组相比,只有 CUUO Ad-MG53组肾脏组织能够检测到MG53的表达,这表明MG53被RAW264.7细胞呈递到了受损的肾脏组织处;与Sham组相比,CUUO none组、CUUO Ad-Vector组的COL-1、COL-3、FN表达量明显升高,统计学有明显的差异,这表明模型建立有效;与 CUUO none 组及 CUUO Ad-Vector组相比,CUUO+Ad-MG53 组的p-IκBα、p-P65的蛋白表达量明显下降,统计学有明显的差异,这表明RAW264.7细胞呈递的MG53能够减轻受损肾脏组织处的NF-κB信号通路的激活及纤维化。结论基于Tet-On系统调控分泌MG53的巨噬细胞能够减轻小鼠梗阻性肾脏的炎症反应及纤维化程度。第四部分 rhMG53治疗梗阻性纤维化的研究目的探讨系统性给予rhMG53是否可减轻CUUO小鼠的NF-κB活化和纤维化,为进一步探讨rhMG53治疗ON提供理论参考依据。材料及方法1.选取8-12周WT小鼠18只,体重（21.5±1.3）g,随机分为Sham组（n=6）与实验组（n=12）。实验组小鼠分别实施CUUO术来诱导肾脏纤维化为CUUO组。CUUO组小鼠随机均分2组,CUUO+生理盐水（saline）组及CUUO+rhMG53组,两组小鼠在最初的7天每天分别接受saline或rhMG53（2mg/Kg）治疗,然后每隔一天接受一次治疗,Sham组作为对照组,只进行切开缝合术,术后不给予生理盐水或rhMG53治疗,在第7天将小鼠处死取材。通过Western Blot、HE染色、Masson染色及IHC染色检测肾脏纤维化变化情况。2.统计学方法:所有实验数据采用均数±标准误（x±s）表示,采用SPSS22.0统计学软件进行分析处理数据,两个样本均数比较采用t检验,多样本均数比较采用单因素方差分析法的两两比较,P＜0.05为差异有统计学意义。结果1.HE染色显示发现相比Sham组,给予saline治疗组CUUO侧肾脏组织形态排列紊乱,肾小管肿胀;与给予saline治疗组相比,CUUO小鼠给予rhMG53治疗后,梗阻侧肾脏组织形态恢复,小管肿胀减轻。Masson染色显示,相比Sham组,给予saline治疗组梗阻侧肾脏组织纤维化明显加重;与给予saline治疗组相比,给予rhMG53治疗后小鼠梗阻侧肾脏的纤维化程度减轻。2.IHC染色发现,相比Sham组,给予saline治疗组梗阻侧肾脏组织表达的MG53稍微增加,肾小管肿胀加重;而给予rhMG53治疗后,免疫荧光染色显示损伤部位MG53明显增加,且小管肿胀程度减轻。结论rhMG53能够减轻CUUO小鼠梗阻侧的炎症反应及纤维化程度。