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研究背景肿瘤浸润淋巴细胞（tumor infiltrating lymphocyte,TIL）疗法是过继性细胞输注（adoptive cell transfer,ACT）疗法的一种,多项在晚期恶性黑色素瘤中的临床研究证实:应用自体TIL细胞输注联合白介素-2治疗的客观缓解率可达49-72%,更让人印象深刻的是,其中有22%的患者肿瘤长期完全缓解。近年来,也有越来越多报道显示TIL细胞回输在黑色素瘤以外的瘤种,比如胆管癌、宫颈癌、结肠癌和乳腺癌患者中也显示出确切的疗效,部分患者肿瘤可完全缓解。而且,最新报道TIL细胞疗法在既往抗程序性细胞死亡蛋白1（Programmed cell death protein 1,PD-1）治疗失败的非小细胞肺癌的小样本临床研究中也显示出相当不错的疗效,在13例可评估的患者中,有两例完全缓解超过18个月。然而,TIL细胞的广泛应用也面临着两大难题:1.取材困难,需要活检或手术获取足够的标本来进行TIL细胞的提取和培养,以至于排除大量患者;2.较高的技术要求和成本。现已明确,TIL细胞疗效佳而且不良反应反应轻微的根本原因是其富含了肿瘤特异性T细胞,它可以精准的识别杀伤肿瘤细胞。近年来,在一些恶性肿瘤患者中的研究显示:其外周血中也存在有肿瘤特异性T细胞,而且进一步的研究发现外周血中PD-1+淋巴细胞富含了肿瘤特异性T细胞。因此,如果将外周血作为来源制备类似TIL的细胞制品,将彻底克服TIL细胞需要通过活检或手术取材的困难。于是,我们设计并实施了本研究。首先,建立一个高效的外周血来源PD-1+淋巴细胞的体外扩增方案,并对由该方法获取的T细胞制品进行初步表型分析。进一步,通过体外实验初步评估扩增所得的细胞制品的抗肿瘤活性,并通过TCRβ测序确定其与配对的TIL细胞的TCR免疫组库的重合度。最后,我们通过小规模的观察性研究对该细胞制品在4例既往抗PD-1治疗失败的晚期恶性肿瘤患者中的安全性和疗效进行了初步评估。第一部分外周血PD-1+淋巴细胞的体外分选及扩增方案的建立研究目的1.建立外周血PD-1+淋巴细胞的体外分选及扩增方案。2.PD-1+淋巴细胞体外扩增前/后的免疫表型分析。3.抗PD-1治疗对外周血PD-1+淋巴细胞体内/外增殖的影响。研究方法1.通过Ficoll密度梯度离心法提取外周血单个核细胞（Peripheral blood mononuclear cell,PBMC）,利用抗生物素-磁珠和生物素偶联的抗人Ig G4抗体分选结合有PD-1抗体的PD-1+淋巴细胞（因为目前上市的PD-1抗体均为Ig G4亚型的抗体）。然后采用我们创立的体外扩增方案(应用X-VIVO TM15无血清培养基,在特定的时间点加入Rereco Nectin、OKT-3、白细胞介素-2和自体血浆)对分选的PD-1+淋巴细胞进行体外扩增。2.应用流式细胞术对体外扩增前后的PD-1+淋巴细胞进行免疫表型分析。3.应用流式细胞术检测患者抗PD-1治疗前及治疗后3周的外周血中PD-1+及Ki67+细胞占比,对比其前后变化情况;分别对抗PD-1治疗前后的外周血进行PD-1+淋巴细胞的分选及体外扩增,对比其体外扩增能力的差别。研究结果1.以50ml外周血为起始,可以在2周时间内将分选的PD-1+淋巴细胞体外扩增至（4.72±0.25）×10~9,获得外周血PD-1+淋巴细胞扩增后的细胞制品（T cells expanded from PD-1+peripheral blood lymphocytes,FPD-1+T细胞）。2.扩增前的PD-1+淋巴细胞和扩增后的FPD-1+T细胞均以CD3+CD8+T和CD3+TCD4+T淋巴细胞为主,其中,FPD-1+T细胞中CD3+CD8+T细胞比例较前扩增前明显增高。3.抗PD-1治疗后,外周血中PD-1+淋巴细胞及Ki67+PD-1+细胞比例均明显增高。而且,外周血PD-1+淋巴细胞的体外扩增速度明显增快。第二部分FPD-1+T细胞的体外抗肿瘤活性研究研究目的1.评价FPD-1+T细胞的体外抗肿瘤活性。2.探讨FPD-1+T细胞的T细胞受体（T cell receptor,TCR）免疫组库与配对的TIL细胞的TCR免疫组库的关系。研究方法1.T细胞功能实验:通过检测FPD-1+T细胞与自体肿瘤细胞共孵育后IFN-γ的分泌情况间接评估T细胞功能（T细胞分泌IFN-γ提示其对肿瘤细胞的特异性识别和杀伤）,应用流式细胞术对其中的肿瘤特异性T细胞（IFN-γ+T细胞）进行定量分析,并以外周血PD-1-淋巴细胞扩增后的细胞制品（T cells expanded from PD-1-peripheral blood lymphocytes,FPD-1-T细胞）为对照。2.四聚体染色实验:分别通过NY-ESO-1157-165四聚体或Mart-126-35四聚体染色试验,对PBMC,扩增前的PD-1+淋巴细胞和PD-1-细胞,以及扩增后的FPD-1+T细胞和FPD-1-T细胞中的特异性靶向肿瘤抗原NY-ESO或Mart-1的T细胞进行定量分析。3.TCR免疫组库测序:应用多重PCR扩增和高通量测序技术,分别对FPD-1+T细胞、FPD-1-T细胞及配对的TIL细胞的TCRβ链互补决定区3（complementarity determining region 3,CDR3）的进行测序,然后分析三组细胞TCR免疫组库之间的关系。研究结果1.T细胞功能实验:FPD-1+T细胞中IFN-γ+T细胞的比例均高于配对的FPD-1-T细胞,具体的:对于CD8+T细胞亚群（5.24±2.31%vs 0.65±0.20%,p=0.048）;对于CD4+T细胞亚群（2.42±0.75%vs 0.38±0.17%,p=0.005）。2.四聚体染色试验:扩增前的PD-1+淋巴细胞以及扩增后的FPD-1+T细胞均富集了四聚体阳性细胞,FPD-1+T细胞中四聚体阳性细胞比例较前扩增前更高。3.TCR免疫组库测序:FPD-1+T细胞与配对的TIL细胞具有更高的克隆重叠。第三部分FPD-1+T细胞临床应用的安全性及疗效的初步评价研究目的1.初步评价FPD-1+T细胞临床应用的安全性。2.初步评价FPD-1+T细胞临床应用的抗肿瘤效果。对象与方法在多线治疗失败的,且对抗PD-1治疗耐药的无标准治疗手段的晚期恶性肿瘤患者中应用自体FPD-1+T细胞回输联合PD-1抗体治疗,初步观察其安全性及疗效。研究结果1.患者特征:4例患者中,2男2女,恶性黑色素瘤3例,肾透明细胞癌1例,均为多线治疗失败且抗PD-1治疗失败,美国东部肿瘤协作组（Eastern Cooperative Oncology Group,ECOG）体力状况（performance status,PS）评分:0到2分不等。2.FPD-1+T细胞扩增及回输情况:单次细胞回输总量在1.24×10~9至6.3×10~9之间,每个患者均完成4次回输。3.安全性:4例患者均未观察到严重的细胞输注相关不良反应,也未观察到严重的免疫相关不良反应。4.疗效:1例患者达到完全缓解,无疾病进展生存期（Progress free survival,PFS）为22个月,目前仍于缓解中;2例患者达到部分缓解,PFS分别为3.3个月和11.2个月;1例患者疾病稳定,PFS为4.9月。结论1.建立了高效、便捷的外周血来源PD-1+细胞的体外扩增方案,由此方案我们能以肿瘤患者50ml外周血为起始,在2周内获得（4.72±0.25）×10~9的FPD-1+T细胞。2.体外研究显示,FPD-1+T细胞富集了肿瘤特异性T细胞,同时,FPD-1+T细胞与配对的TIL细胞具有更高的克隆重叠。3.小样本观察性临床研究显示,在既往PD-1抗体耐药的晚期恶性肿瘤患者中,自体FPD-1+T细胞回输联合PD-1抗体治疗具有良好的安全性和疗效。