研究背景和目的全世界恶性肿瘤发病率和死亡率均呈上升的趋势,加快肿瘤病因和发病机制的研究以及探索有效的肿瘤治疗新方法显得尤为重要。利用转基因技术建立人类肿瘤疾病的转基因动物模型,研究外源基因在整体动物中表达的调控规律,从而对揭示人类肿瘤的病因、发病机制和治疗学研究将会起到极大的促进作用。目前,用于肿瘤发生机制研究的肿瘤动物模型绝大多数是基于遗传工程小鼠建立的,此类人类肿瘤动物模型在肿瘤发生机制研究中已发挥了重要作用。但是,小鼠在解剖、生理、生化代谢等方面与人类的有较大差异,基于其所获信息无法完全真实揭示人类肿瘤发病情况;同时小鼠生理寿命很短,因而基于小鼠建立的肿瘤动物模型无法模拟肿瘤发生、发展、转移及复发的整个动态过程。而小型猪作为大型实验动物,具有解剖生理特性与人类更为相似,器官大小与人类更为接近,寿命长以便进行长期观察及相关处理等的特点。因此,该模型的建立将有望更为真实的模拟人类肿瘤发生、发展、转移和复发等整个动态过程,有助于人类更好认识肿瘤发病机制。此外,该模型也将有助于人类肿瘤治疗的临床前研究,并基于其寻找到更佳的临床治疗策略和方案等。c-Myc蛋白属于Myc家族的转录因子,其中还包括N-Myc和L-Myc基因。研究表明,c-Myc基因所调控的基因几乎占了所有基因的15%,通过修改其靶基因的表达,c-Myc蛋白在调控正常细胞增殖、生长、分化、凋亡、存活以及干细胞自我更新以及多潜能性的建立和维持等方面扮演着重要的角色。作为一个经典的原癌基因,c-Myc在很多恶性肿瘤中表达均有上调。已有研究报道,在小鼠身上的不同脏器转基因过表达c-Myc,如肝脏、乳腺,均可诱导形成肝癌或乳腺癌。为此我们选定此基因作为制作人类肿瘤动物模型的目的基因并开展相关工作。通常,确定某个基因是否是瘤基因最可靠和最经典的策略和方法是在转基因小鼠体内过表达该基因,并进而观察病理改变。但是,基于大动物制作转基因动物模型具有耗资大,耗时久的缺点。为了降低风险,我们先采取了体外实验来验证该目的基因是否为瘤基因。有鉴于此,我们以讨论c-Myc在体外能否成功诱导猪胚胎成纤维细胞的恶性转变以及相关研究作为本课题的重点。本课题将从以下几个方面开展研究:(1)明确单个c-Myc能否诱导猪胚胎成纤维细胞发生恶性转化;(2)明确恶性转化是一个逐渐发生的过程;(3)猪肿瘤干细胞相关研究。(4)探讨间充质-上皮转化(MET)在c-Myc诱导猪成纤维细胞恶性转化中的作用及机制。研究方法及结果如下:1.建立稳定过表达c-Myc转基因的猪胚胎成纤维细胞1.1利用慢病毒载体pLenti-EF1α-c-Myc-IRES-EGFP生产慢病毒用经本课题组转化、酶切及测序鉴定后的pLenti-EF1α-c-Myc-IRES-EGFP或pLenti-EF1α-IRES-EGFP和psPAX2及pMD2.G共转染293T细胞,包装产生两种慢病毒,即携带空载的慢病毒(LV-con)和携带c-Myc的慢病毒(LV-c-Myc);转染后24h,荧光显微镜下可见293T细胞发出绿色荧光。转染后72h,收集病毒上清经超速离心及过滤后使用和保存等。1.2稳定过表达c-Myc转基因的猪胚胎成纤维细胞(PEFs)的的建立将慢病毒LV-c-Myc和LV-con感染PEFs,感染48h后荧光显微镜下可见绿色荧光。1.3 c-Myc转基因表达检测Western blot和免疫荧光检测显示,c-Myc转基因在携带c-Myc转基因的PEFs上能够正常表达。稳定过表达c-Myc转基因的PEFs命名为PEF-c-Myc,携带空载的细胞为LV-con细胞。2.体外实验表明PEFs上过表达转基因c-Myc促进细胞增殖2.1平板克隆形成实验检测PEF-c-Myc(简称P-C3.29细胞)增殖能力与LV-con对照细胞相比,P-C3.29细胞形成的平板克隆数目显著增高(P<0.05),这提示P-C3.29细胞在体外增殖能力比LV-con细胞显著提高。2.2 CCK-8检测细胞增殖能力利用CCK-8试剂盒检测细胞的增殖能力。细胞OD值在两组间差异具有统计学意义,在不同天数差异具有统计学意义;两组细胞的OD值,从第三天开始随时间增加差异具有统计学意义,到第五天差异越发显著(P值均小于0.05)。结果表明:P-C3.29细胞在体外比LV-con细胞具有更强的增殖能力。2.3流式细胞仪检测细胞周期收集对数生长期细胞,利用PI(碘化丙啶)标记的方法,通过流式细胞仪对细胞内DNA的相对含量进行测定,可分析细胞周期各时相的百分比。结果显示:P-C3.29细胞的增殖指数(S期和G2/M期细胞之和占总细胞数的百分比)比LV-con细胞显著增高(P<0.05),提示P-C3.29细胞在体外比LV-con细胞具有更强的增殖能力。2.4 EdU检测细胞增殖能力EdU(5-乙炔基-2’脱氧尿嘧啶核苷)是一种胸腺嘧啶核苷类似物,能够在细胞增殖时期代替胸腺嘧啶(T)渗入正在复制的DNA分子中,通过基于EdU与荧光染料的特异性反应快速检测细胞DNA复制活性。我们采用倒置荧光显微镜来观察增殖细胞的染色情况。结果显示:P-C3.29细胞中EdU阳性细胞占总细胞数百分比显著高于LV-con细胞中的EdU阳性细胞比(P<0.001),提示P-C3.29细胞在体外比LV-con细胞具有更强的增殖能力。3.裸鼠皮下移植P-C3.29细胞能够形成恶性组织3.1 P-C3.29细胞移植至裸鼠皮下,并鉴定所形成肿块的组织类型分别在裸鼠皮下接种P-C3.29细胞及LV-con空载细胞,至观察日期截止LV-con空载细胞处未见肿块出现,而在总共25个P-C3.29细胞移植点处先后发现有24处形成肿块。我们采用小动物活体成像仪动态监测成瘤情况,发现在肿块发生坏死之前,移植点处EGFP的荧光信号是逐步增强的。接下来我们取出裸鼠皮下形成的肿块组织,分别通过体视荧光显微镜及组织冰冻切片检测EGFP的表达以进一步鉴别组织类型和来源,结果显示离体组织均有EGFP的表达。接着我们取部分组织行固定并石蜡包埋和切片,HE染色结果为:细胞大小不一,细胞核大且深染,可见病理性核分裂象,细胞明显异性。同时,我们也对组织行BrdU和Ki67免疫组化染色,染色结果显示,绝大部分均为BrdU和Ki67阳性细胞。以上结果表明,皮下成瘤组织具有恶性组织细胞典型的病理特征,提示经c-Myc感染后的PEFs细胞发生了恶性转化。3.2行裸鼠皮下二次成瘤,并鉴别所形成肿块的组织类型3.2.1成功制备一次成瘤后组织的原代细胞取新鲜的P-C3.29皮下成瘤后组织制备原代细胞,命名PCY1,细胞呈圆形,较P-C3.29细胞体积明显减小,具有易漂浮,多层生长的特性。荧光显微镜观察到EGFP的表达,至此成功制备一次成瘤后原代细胞PCY1。3.2.2 PCY1细胞移植至裸鼠皮下,并鉴定所形成肿块的组织类型为了确定PCY1细胞是否有再次成瘤的能力,我们将PCY1细胞接种至裸鼠皮下,共移植10个点,10个点均形成肿块。小动物活体成像仪动态监测成瘤情况,发现肿块仅在两周内就达信号最高强度值,提示该肿块增长速度较一次成瘤时明显加快。同样,我们取出二次成瘤的组织,分别通过体视荧光显微镜及组织冰冻切片检测EGFP的表达以确定组织来源,结果显示离体组织均有EGFP的表达。而HE染色,BrdU和Ki67免疫组化染色结果也都同一次成瘤后的结果相似。以上结果表明,二次成瘤的组织也具备恶性组织的特性,且PCY1的体内增殖能力强于P-C3.29。同一次成瘤后组织原代细胞培养的制作,我们将二次成瘤后的组织也用于制备原代细胞将其命名为PCY2。4.P-C3.29、PCY1、PCY2细胞染色体核型分析和端粒酶活性检测4.1核型分析收集处于对数生长期的P-C3.29、PCY1、PCY2及空白对照PEFs细胞送至南方医院产前诊断中心做染色体核型分析,结果显示:P-C3.29、PCY1和PEFs细胞共19对染色体,未见缺失、畸变和异位等染色体异常改变;PCY2细胞除有19对38条染色体等的正常核型表现外,还可出现染色体数目减少或增多的异常改变。4.2端粒酶检测TRAP法检测端粒酶活性:TERT(端粒酶逆转录酶)是端粒酶中具有逆转录酶活性的催化亚基,其表达在正常细胞中受到抑制。端粒酶活化是细胞永生化和肿瘤形成的关键步骤,恶性肿瘤细胞内端粒酶活性升高,而作为端粒酶催化亚单位的端粒酶逆转录酶,其转录水平上调是端粒酶激活的关键步骤。据此,我们通过TRAP扩增技术把分别经过加热与未加热的端粒酶提取物用来扩增端粒酶产物,经PAGE凝胶电泳,SYBR green染色后利用紫外透射仪观察染色带情况。结果显示:PCY1、PCY2细胞的染色条带多于P-C3.29,提示PCY1、PCY2细胞中的端粒酶活性高于P-C3.29细胞。荧光定量PCR检测TERT基因的表达:P-C3.29、PCYI、PCY2细胞中端粒酶相关基因TERT表达水平依次升高,且差异具有统计学意义(P<0.05)。5.恶性转变是一个渐进的过程5.1激光扫描共聚焦显微镜观察裸鼠皮下成瘤前后细胞的形态变化我们对LV-con、P-C3.29、PCY1、PCY2细胞行细胞免疫荧光染色,利用EGFP抗体放大信号以便更好的观察其形态特点,结果显示:P-C3.29细胞较LV-con细胞体积明显缩小,由长梭形变成短梭、多角形,细胞核浆比增高;PCY1、PCY2细胞较P-C3.29细胞体积进一步缩小,由长梭形变成圆形,细胞核浆比进一步增高。5.2移植前后细胞生长方式的变化我们对比了 LV-con、P-C3.29、PCY1和PCY2细胞生长方式,与移植前的P-C3.29细胞及空载细胞相比,移植后细胞在体外培养呈集落样生长,细胞间失去接触抑制,细胞贴壁不牢、易漂浮。5.3裸鼠皮下成瘤前后细胞增殖能力的变化细胞周期结果显示:PCY1和PCY2细胞的增殖指数较P-C3.29细胞显著增高(P<0.05),而PCY1和PCY2细胞间并无明显差异,提示PCY1和PCY2细胞在体外比P-C3.29细胞具有更强的增殖能力。EdU检测结果显示:我们采用流式细胞仪检测细胞的增殖能力。结果显示:P-C3.29细胞中所含EdU阳性细胞比显著高于PCY1和PCY2细胞(P<0.001),PCY1与PCY2细胞间无明显差异。提示PCY1与PCY2细胞比P-C3.29细胞在体外具有更强的增殖能力,而PCY1与PCY2细胞间增殖能力并无明显差异。6.猪肿瘤干细胞(CSCs)相关研究6.1恶性转化后的细胞中存在CSCs且含量不同6.1.1 qRT-PCR及Western blot检测干性相关基因表达分别收集P-C3.29成球与贴壁细胞,PCY1成球与贴壁细胞,PCY2成球与贴壁细胞的总RNA及蛋白,通过qRT-PCR及Western blot检测干性相关基因(c-Myc、Oct4、CD44、Sox2、ABCG2)表达情况。qRT-PCR检测结果显示:在P-C3.29组中,成球细胞干性相关基因Oct4、Sox2表达上调,差异具有统计学意义;PCY1组中,成球细胞Oct4、CD44、Sox2、ABCG2(P值均小于0.05)表达水平均上调,差异具有统计学意义;PCY2组中,成球细胞Oct4、CD44、Sox2(P值均小于0.05)表达上调,差异具有统计学意义。Western blot检测结果显示:在P-C3.29成球细胞中,干性相关基因c-Myc、Oct4、Sox2表达显著上调;在PCY1成球细胞中,c-Myc、Oct4、Sox2表达增高;在PCY2成球细胞中c-Myc、Oct4、Sox2、ABCG2表达显著上调。6.1.2流式细胞仪检测侧群细胞(SP)含量侧群(SP)细胞是通过流式细胞技术分选出来的能将核酸染料Hoechst 33342外排至细胞外,在双荧光图上位于主体细胞群落荧光弱侧的一类细胞群。SP细胞作为一类被普遍认为富含干细胞样细胞的群落,为我们对干细胞方面的研究提供了一种策略。在我们对P-C3.29、PCY1、PCY2这三种细胞进行流式分选时发现:PCY1和PCY2细胞中所含的SP细胞比例显著高于P-C3.29细胞组(P<0.01),而PCY1与PCY2细胞组间SP细胞含量并无明显差异。6.1.3肿瘤球形成能力的比较成球能力是肿瘤干细胞体外鉴定的一个重要方法,其判断的是单个细胞在合适的条件培养基中自我更新的能力。我们将制备好的P-C3.29、PCY1、PCY2单细胞悬液放在加有B27、生长因子等添加剂的无血清培基中培养,经连续观察发现:PCY1、PCY2细胞在成球数目及大小上都显著高于P-C3.29细胞(P<0.01),而PCY1与PCY2细胞组间在成球数目及大小上并无明显差异。这提示PCY1、PCY2细胞形成肿瘤球的能力远强于P-C3.29细胞。6.2评价恶性转化后细胞中CSCs的耐放疗特性肿瘤干细胞被看作是肿瘤治疗后复发的根源,它能抵抗各种治疗方法并最终导致治疗失败。我们将培养贴壁的细胞送至南方医院肿瘤放疗中心,分别在0、2、4、6、8、10Gy六个剂量下照射细胞,接着我们把经过放疗照射的细胞制成单细胞悬液后接种于肿瘤球培养基中,通过其肿瘤球形成能力来评价P-C3.29、PCY1、PCY2细胞中肿瘤干细胞的差异。结果显示:随照射剂量的增加,P-C3.29、PCY1、PCY2细胞形成肿瘤球的能力逐渐减弱,从6Gy后,P-C3.29、PCY1、PCY2细胞均未见有肿瘤球形成;PCY1细胞在2Gy和4Gy的照射剂量下均能形成肿瘤球,且成球数量显著小于0Gy下的PCY1细胞(P<0.01);PCY2细胞仅在2Gy的照射剂量下形成肿瘤球,且成球数量显著小于OGy下的PCY2细胞(P<0.01);而P-C3.29从2Gy开始就未能形成肿瘤球。以上结果表明,PCY1和PCY2中所含干细胞数量明显高于P-C3.29。6.3体内实验进一步证实CSCs存在为了进一步鉴定肿瘤干细胞的存在,我们选择P-C3.29与PCY1细胞进行梯度移植瘤实验。我们分别以 1x106、5x105、5x104、5x103、5x102、2.5x102、2.5x101七个剂量来移植P-C3.29与PCY1细胞,结果显示:P-C3.29细胞在5x104及以下的移植剂量均未见肿块形成,而PCY1细胞在2.5x102的移植剂量下仍能形成肿块,而到观察日期截止时2.5x102和2.5x101的移植剂量处均未见肿块形成;PCY1细胞所形成的肿块生长速度明显快于P-C3.29,高剂量移植处的肿块生长速度明显快于低剂量处肿块的生长速度。可见,PCY1细胞中所含干细胞的数量明显多于P-C3.29细胞。结论:(1)过表达c-Myc基因能将猪胚胎成纤维细胞转变为恶性细胞,同时将过表达c-Myc转基因的猪胚胎成纤维细胞移植至裸鼠皮下能形成恶性组织;(2)恶性转变是一个逐渐发生的过程;(3)恶性转化后的细胞中存在肿瘤干细胞,并且其含量及耐放疗能力随恶性转变进程的深入而增加;(4)已有研究报道c-Myc过表达可在猪皮肤和胚胎成纤维细胞上诱导间充质-上皮转化(MET),同时相关间接证据提示c-Myc诱导的MET有可能在c-Myc将猪胚胎成纤维细胞转变为恶性细胞的过程中发挥重要作用,c-Myc诱导的MET亦有可能是c-Myc将猪胚胎成纤维细胞转变为恶性细胞的一个早期必经事件,这有待进一步实验加以证实。