论文部分内容阅读
背景和目的胸腺是免疫系统中一个非常重要的器官,是T淋巴细胞发育和成熟的场所。胸腺淋巴细胞祖细胞是骨髓来源的细胞,迁移到胸腺,在胸腺中经历阳性选择、阴性选择,然后分化成为初始T细胞,在细胞免疫防御中起着核心作用。与其他器官不同,胸腺受感染、年龄、怀孕、精神紧张、营养不良等因素影响,会发生萎缩,称为胸腺萎缩或退化。T细胞输出的减少不仅会增加感染传染病的风险,还会增加癌症、代谢性疾病和自身免疫性疾病等发病率的风险。然而,胸腺退化的分子机制仍不完全清楚。脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）是革兰氏阴性细菌的主要细胞表面粘多糖成分。LPS有助于避免细菌不受细胞外威胁,还可以有效激活机体先天免疫系统并引起炎症反应。腹腔注射LPS通常用于建立脏器损伤,如肝、肾。LPS是炎症反应的重要诱导剂之一,且广泛应用于各种炎症模型的构建。本研究旨在探讨脂多糖诱导的炎症应激下的急性胸腺萎缩和恢复的相关机制,我们采用免疫组织化学、流式细胞术、定量PCR、免疫印迹等方法探讨胸腺组织结构和胸腺细胞亚群的变化,并分析相关蛋白的表达。结果表明,LPS处理能诱导小鼠胸腺发生明显萎缩,自身免疫调节因子（Autoimmune regulator,Aire）的表达减少,胸腺上皮细胞粘附分子（Epithelial cell adhesion molecule,Epcam）和干细胞转录因子（Sex determining region Y,Sox2）表达增加,线粒体膜电位去极化,衰老细胞减少。本研究的数据期望能为胸腺的萎缩和重塑提供理论基础。方法1.实验动物2月龄昆明雌鼠共20只,随机分成2组,每组各10只。LPS组:腹腔注射100mg/kg LPS,对照组:腹腔注射0.9%Na Cl,在注射后的第四天和第七天,分别取小鼠的胸腺组织备用。2.胸腺组织学分析和流式细胞术检测（1）石蜡切片,HE染色观察胸腺组织的结构变化;（2）胸腺衰老相关指标检测:冰冻切片,衰老相关β-半乳糖苷酶（senescence associated-β-galactosidase,SA-β-Gal）染色,检测胸腺组织中衰老细胞的变化情况;（3）流式细胞术:研磨胸腺组织后,把胸腺细胞进行分离,分析胸腺细胞亚群的变化情况;（4）免疫组织化学:检查Aire、Epcam和Sox2的表达和定位;（5）荧光定量PCR:提取胸腺组织的RNA,逆转录,定量PCR,检测Aire m RNA的表达。3.胸腺组织线粒体功能荧光酶标仪检测:小鼠胸腺组织中线粒体JC-1膜电位、活性氧（reactive oxygen species,ROS）水平的变化。4.蛋白质免疫印迹（Western blot,WB）通过WB方法分析:小鼠胸腺组织中信号通路蛋白:乙酰化酶1（Sirtuin type1,Sirt 1）、腺苷酸活化蛋白激酶（Adenosine Monophosphate Activated Protein Kinase,AMPK）、磷酸化的腺苷酸活化蛋白激酶（p-AMPK）、核转录因子（Nuclear Factor-Kappa B,NF-kb）的表达。结果1.LPS使得小鼠的胸腺体积缩小,胸腺指数明显下降,胸腺皮质变薄,皮髓质结构紊乱,皮髓质边界也不清晰。LPS处理的第七天时,小鼠胸腺体积大小恢复,胸腺指数升高,小鼠的胸腺结构也趋于正常。2.LPS使得小鼠的胸腺中衰老细胞明显增高;在注射LPS第七天的时候,小鼠胸腺中的衰老细胞恢复正常。3.流式细胞术结果显示,LPS处理后,胸腺细胞亚群明显发生了紊乱,小鼠胸腺CD4-CD8-细胞的比例明显升高,而CD4+CD8+细胞的比例明显下降,CD4-CD8+细胞的比例明显升高,同时,CD4+CD8-细胞的比例也是明显升高的。在注射LPS第七天的时候,小鼠胸腺细胞亚群趋于正常水平。4.免疫组织化学的检测结果显示,LPS组的小鼠胸腺中Aire阳性的细胞明显减少,且Aire的表达位置在皮髓质都有。第七天时,Aire的表达量恢复了正常,主要表达在髓质。荧光定量PCR的结果,进一步表明注射LPS的第四天时,Aire的表达下降,第七天时,Aire的表达又恢复了正常。LPS处理能够促进小鼠胸腺中Epcam和Sox2的表达,且阳性细胞主要分布在胸腺组织的皮髓质交界处。LPS处理的第七天时,Epcam和Sox2的表达能够恢复到正常水平。5.线粒体JC-1膜电位和ROS的变化:LPS处理使得小鼠胸腺线粒体JC-1膜电位水平下降显著,ROS生成明显升高。在注射LPS第七天的时候,小鼠胸腺线粒体JC-1膜电位和ROS恢复了正常水平。6.WB的结果显示,LPS处理第四天后,小鼠胸腺组织中Sirt 1和p-AMPK的表达明显下降,AMPK和NF-kb的表达没有统计学差异。在注射LPS第七天时,小鼠胸腺组织中Sirt 1和p-AMPK的表达恢复了正常。结论LPS处理能使胸腺发生显著应激性萎缩,正常的皮髓质结构被破坏,胸腺细胞亚群改变,相关因子的表达发生改变;胸腺线粒体功能失常,从而胸腺萎缩、退化;LPS能激活胸腺祖/干细胞相关因子,通过自身补偿机制,恢复了胸腺正常的组织结构和相关因子表达。