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使用木质纤维素降解物作为工业发酵的原料,具有优化资源利用,保护环境,避免工业与人争粮等优势,是目前最重要的技术发展趋势之一。采用目前最廉价和最有效的技术方法处理木质纤维素,所获得的产物是含有各种戊糖和己糖混合糖液,其中以木糖和葡萄糖为主。由于大多数工业微生物都不能利用木糖,或者不能进行木糖和葡萄糖共代谢,限制了木质纤维素降解物作为工业发酵原料的实际应用。本文对枯草芽孢杆菌的木糖代谢相关基因进行了遗传改造,为改善枯草芽孢杆菌的木糖代谢进行了初步探索。
构建了用于同源重组敲除B.subtilis168菌株araE基因的重组质粒T-AEE,经转化E.coli top10进行了质粒的克隆和验证。用质粒T-AEE转化168菌株感受态细胞,用红霉素抗性平板筛选到了转化子。经提取染色体进行PCR扩增和酶切电泳验证,显示抗性基因片段正确插入到了araE基因内的预定位点,获得了araE基因缺陷菌株168 araE。构建了用于同源重组敲除B.subtilis168C菌株xylR基因的重组质粒T-XC,经转化E.coli top10进行了质粒的克隆和验证。用质粒T-XC转化168C菌株感受态细胞,用氯霉素抗性平板筛选到了转化子。经染色体PCR验证和酶切电泳验证,显示抗性基因片段正确插入到了xylR基因内的预定位点,获得了araR和xylR双基因缺陷的重组菌株168C xylR-。
分别比较了B.subtilis168、168 araE、168C和168C xylR-菌株在不同培养基上的生长状态。在葡萄糖或木糖为碳源的固体基本培养基上,四株菌的生长没有区别,生长24h,菌落直径小于1mm。在液体基本培养基上,四种菌的生长速率和最大生物量有细微差异,但生物量都在1OD上下。在木糖发酵培养基中,168C与168C xylR-的最大生物量明显高于菌株168,168 araE-则明显低于168菌株。生长实验显示,敲除B.subtilis168的araR基因,能够改善细胞的木糖吸收。