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云芝糖肽是从液体发酵的云芝[Coriolus versicolor(L.er.Fr)Quei.]Cov-I菌丝体中水提醇沉得到的一种多糖肽,具有抗肿瘤和提高机体免疫功能的显著效果,并已批准作为肿瘤辅助治疗药物。采用液体发酵和水提醇沉工艺生产的云芝糖肽存在着得率低、成本高的技术瓶颈。为提高生产效率、降低成本、增加收益,本论文从云芝诱变育种、发酵工艺和提取工艺优化三个方面来寻找突破技术瓶颈的方法。
本文以云芝Cov-I菌株为出发菌株制备云芝原生质体,采用紫外诱变进行原生质体诱变育种,并结合溶壁酶的耐受能力进行筛选。从诱变得到的301株菌中筛选到1株遗传性质较稳定、适合液体培养的云芝诱变菌株——YUBV93。该菌在PDA斜面上生长速度较快,菌丝茂密,经液体发酵培养得到的菌丝体干重、粗多糖肽得率及产品中总多糖含量均略高于出发菌株。
通过对云芝中糖肽类物质提取工艺的研究,确定了提取云芝胞内糖肽类物质的优化工艺条件,并对提取的糖肽类物质进行了糖和蛋白质的定量分析。结果,水提法获取的云芝糖肽得率为4.9%,总糖含量为36.8%、蛋白含量为26.5%;碱提法获取的云芝胞内糖肽得率为10.4%,总糖含量为39.0%、蛋白含量为28.0%;冷碱提残渣获取的云芝胞内糖肽得率为3.6%,总糖含量为37.3%、蛋白含量为27.0%;热碱提残渣获取的云芝胞内糖肽得率为3.8%,总糖含量为38.2%、蛋白含量为27.8%;云芝胞外糖肽的得率为1.15%,总糖含量为50.2%、蛋白含量为30.5%。提取云芝胞内糖肽类物质的优化条件为:先用传统的水提醇沉法提取水溶性糖肽类物质,再依次用25℃冷碱和90℃热碱各提取菌丝体残渣2次以获取碱溶性糖肽类物质。
对云芝菌丝体发酵工艺的研究发现,Mg2+、Ca2+、EDTA、甘油和植物油对云芝菌丝体及其糖肽产量都有促进作用。通过单因素比较研究确定了Mg2+、Ca2+、EDTA、甘油和植物油的最适添加量分别为0.3%、0.3%、0.0002%、3%和7%,此条件下每150mL发酵液中干菌丝体的产量分别为1.52g、1.41g、1.40g、1.69g、2.25g,比原培养基的产量分别提高了26%、17%、18%、37%和87%,而菌丝体中云芝糖肽的提取率及其总糖含量则无明显改变,分别为4.93%、4.87%、4.92%、4.97%、4.99%和36.97%、37.02%、36.85%、36.84%、36.90%。
以YUBV93为出发菌株,发酵培养基中添加7%的植物油和0.3%的MgCl2并采用优化的提取条件后,每升菌丝体干重可达3.49g、胞内糖肽得率12.52%、总糖含量37.85%、蛋白含量28.13%,比原始的工艺分别提高了86.8%、153.9%、2.5%和6.1%。