拟穴青蟹(Scylla paramamosain)是我国比较受欢迎的海产蟹类之一。所以,研究者对于青蟹的关注日益增加,尤其是对于人工养殖和育苗过程中面临的问题,主要是关于养殖规模小、膏蟹产量低、性早熟、溞状幼体到仔蟹培育时死亡率高、病害等。甲壳类内分泌学方面的研究对于这些问题的解决具有重要的指导意义。甲基法尼酯(Methyl farnesoate,MF)是调节拟穴青蟹生长发育和繁殖过程中重要的内分泌激素之一,由大颚器(Mandibular organ,MO)合成和分泌,在青蟹性成熟和幼体变态发育中起着至关重要的作用。本论文以拟穴青蟹内分泌激素MF为主线,借助RACE技术克隆获得拟穴青蟹MF合成过程中的几个关键调控基因,同时采用实时荧光定量PCR技术对其不同幼体发育时期、不同卵巢分期及不同组织的表达模式进行分析,探讨这些基因在个体发育过程中的作用,并对保幼激素酸甲基转移酶(juvenile hormone acid methyl transferase,JHAMT)的蛋白表达进行分析,为解决拟穴青蟹人工养殖和育苗中出现的问题提供参考理论基础。获得的主要研究成果如下:1.拟穴青蟹FPPS、FoD和FaD基因的克隆及表达分析。法尼基焦磷酸合酶(farnesyl diphosphate synthases,FPPS)、法尼醇脱氢酶(Farnesol dehydrogenase,FoD)或法尼醛脱氢酶(Farnesal dehydrogenase,FaD)是甲壳动物MF合成过程中的关键调控酶。FPPS催化多步反应最终生成法尼焦磷酸(farnesyl diphosphate,FPP),FoD催化法尼醇生成法尼醛,FaD催化法尼醛生成法尼酸(FA)。本文获得了这三个基因的序列,分别命名为Sp-FPPS、Sp-FoD和Sp-FaD。Sp-FPPS全长为1548 bp,其中ORF为1290 bp,编码429个氨基酸。序列分析发现含有焦磷酸合酶的结构域,其中有两个高度保守的天冬氨酸基序,可能与酶的功能位点有关。qPCR表达分析表明,Sp-FPPS在幼体发育的三个重要时期(溞状幼体3期、5期和大眼幼体期)变化极为显著,在成体组织中的表达量最高在大颚器中,肌肉中表达次之这提示基因FPPS的功能与个体发育特别是幼体发育的关系极为密切。在卵巢发育的四期表达量比较显著,此时青蟹合成的MF含量也比较高,这与Sp-FPPS与MF合成相关的观点相符。拟穴青蟹Sp-FoD基因的cDNA全长为2269 bp,ORF为1137 bp,编码378个氨基酸,5’UTR和3’UTR分别为152bp和980 bp。预测蛋白分子量为40kD,等电点为6.71。预测发现其不含信号肽,不是一个分泌类蛋白。在序列中含有醇脱氢酶活性位点和NAD结合域。该基因序列高度保守,与其他物种中的功能相似。幼体表达模式与Sp-FPPS的表达模式很相像,而在组织表达分析中表达量最高是在肌肉中,表皮中次之。与Sp-FPPS在不同卵巢发育时期的表达模式极为相似,推断两者的时间表达一致。拟穴青蟹FaD基因(Sp-FaD)的cDNA全长为1749 bp,开放阅读框为1506 bp,编码501个氨基酸。预测蛋白分子量为56kD,等电点为6.2。预测含有醛脱氢酶谷氨酸活性位点,序列相对保守。qPCR结果表达分析表明,FaD在幼体发育的溞状幼体2期、3期和5期变化极为显著,成体组织表达分析在大颚器中表达量最高,在卵巢的发育四期和六期表达尤为显著。2.拟穴青蟹保幼激素酸甲基转移酶的蛋白分析。保幼激素酸甲基转移酶(JHAMT)是JH合成途径中的关键酶,是存在于节肢动物体内的甲基转移酶家族成员。现在有猜测认为它有可能是甲壳动物中MF合成的关键酶。通过构建pET28a-SpJHAMT重组表达载体,转化表达菌株,获得的重组蛋白SpJHAMT,然后进行纯化、复性。从而获得比较纯净的重组蛋白。综上所述,本文对MF合成通路上的三个酶基因进行了初步研究,表明它们的表达可能与MF的合成相关;并对合成MF最后一步的关键酶基因JHAMT成功构建了载体获得了重组蛋白为它的功能验证做好准备,为了更深入的研究MF合成机制奠定了基础。