虾加工副产物酶促水解制备抗氧化肽的研究

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本文以虾加工副产物-虾头壳蛋白资源为原料,采用可控酶解技术,以抗氧化活性为指标,通过对其原材料预处理、酶的筛选、水解条件的优化等制备抗氧化酶解物,并测定其氨基酸组成、分子量范围,评价其抗氧化能力及抗氧化稳定性,通过逐级层析、反相色谱及电喷雾离子化质谱法对其进行分离纯化与结构鉴定,初步探讨其抗氧化机理。主要研究结果如下:(1)虾加工副产物的脂肪含量为1.5%,原料脱脂后进行酶解,可溶性蛋白含量和水解度均下降,但DPPH自由基清除活性却增强。(2)以脱脂后的虾加工副产物为底物,比较碱性蛋白酶,风味蛋白酶,胰蛋白酶,复合蛋白酶,中性蛋白酶和胃蛋白酶等六种蛋白酶对水解度和DPPH自由基清除率的影响。结果表明,使用碱性蛋白酶时,水解度大,DPPH自由基清除率高;六种蛋白酶水解液中肽的相对分子量分布差别不大。(3)在碱性蛋白酶水解单因素试验的基础上,以DPPH和ABTS自由基清除率为指标,采用响应面设计进行优化酶促水解条件。DPPH自由基清除率为指标的最佳酶解条件为:pH7.2,温度50.5℃,加酶量415U/g,时间120min,此时水解度为21.8%,DPPH自由基清除率为66.9%,平均肽段长度为4.6。ABTS自由基清除率为指标的最佳酶解条件为:pH8.4,温度59.6℃,加酶量597.3U/g,时间120min,此时水解度为40.2%,ABTS自由基清除率为38.8%,平均肽段长度为2.5。水解度与自由基清除率之间相关性不高,因此在酶促水解获得高DPPH、ABTS自由基清除能力肽时不能完全依靠水解度来作为衡量标准。(4)以DPPH自由基清除率为指标、优化所得的酶促水解液为研究对象,测定其氨基酸组成、分子量分布、抗氧化性能并通过超滤分析其具有较强抗氧化活性的分子量范围。结果表明:(a)酶解液中含有较多的Glu,Asp和Gly等呈味氨基酸,含量占44.0%,必需氨基酸占32.1%,疏水性氨基酸占40.3%。(b)酶解液中大部分肽的相对分子量低于6500Da。分子量小于1000Da的组分具有较强的抗氧化活性,超滤能有效的对其按照分子量大小进行分离。(c)通过测定酶解液的DPPH、ABTS自由基清除能力、还原力和亚铁离子螯合能力来评价其抗氧化能力。酶解液和阳性对照BHT的DPPH自由基清除率IC50值分别为0.50、0.29μg/mL,ABTS自由基清除率IC50值分别为7.2和7.4μg/mL;还原力评价中吸光度为0.5时,酶解液的蛋白质浓度为4.8mg/mL,BHT的浓度为0.22mg/mL;蛋白质浓度为0.12mg/mL的酶解液其亚铁结合能力为38.9%,而浓度为0.1mg/mL的EDTA其亚铁结合能力为73.4%,通过与BHT和EDTA的比较看出,酶解液具有较强的抗氧化活性。(5)在抗氧化稳定性实验中,以DPPH自由基清除率为抗氧化指标,当温度达到100℃时,其抗氧化活性保持率仍在90%以上;当酸度降到pH2时,活性保持率在70%左右;葡萄糖、蔗糖对活性有一定影响,但活性保持率均在80%以上;氯化钠、苯甲酸钠对活性的影响很小;各种金属离子中,锌离子与铜离子对活性影响很大,随着离子浓度的提高影响增大。因此加工过程应尽量避免强酸环境,避免与含有锌离子、铜离子的物质接触。(6)酶解液经甲醇脱色后,通过阳离子交换色谱、凝胶过滤色谱、半制备及分析型反相高效液相色谱得到高DPPH自由基清除活性的目标肽。各组分在50μg/mL的浓度下,其DPPH自由基清除活性从最初的20.7%上升到了65.7%,经电喷雾离子化质谱法测定其分子量为804.4Da,氨基酸序列为Ser-Val-Ala-Met-Leu-Phe-His,推测其高抗氧化活性可能与C末端的Phe-His结构有关。
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