【摘 要】
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实时荧光定量PCR（quantitativereal-time PCR,qPCR）作为常用的核酸检测技术已被广泛应用于疾病的预防、诊断和治疗。然而液态qPCR试剂各组分用量小、配制复杂繁琐,对操作环境和人员素质要求高,加之难以在常温下维持活性,限制了其在中心实验室以外的使用。真空冷冻干燥技术（冻干）可以使qPCR试剂以预混装的形式脱水并在常温下长期保持活性,使用时只需加水复溶即可,有望在中心实验室
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实时荧光定量PCR（quantitativereal-time PCR,qPCR）作为常用的核酸检测技术已被广泛应用于疾病的预防、诊断和治疗。然而液态qPCR试剂各组分用量小、配制复杂繁琐,对操作环境和人员素质要求高,加之难以在常温下维持活性,限制了其在中心实验室以外的使用。真空冷冻干燥技术（冻干）可以使qPCR试剂以预混装的形式脱水并在常温下长期保持活性,使用时只需加水复溶即可,有望在中心实验室及以外的多种场景广泛使用。本研究旨在建立—种基于冻干技术的qPCR试剂常温保存方法。首先,基于qPCR试剂的初始冻干体系确定了冻干试剂的性能评估指标。尔后,采用此标准,分别探索了针对RNA和DNA检测的qPCR试剂的最优冻干添加剂组合和使用浓度、最佳冻干程序以及最优的qPCR反应体系,确定了各自的最终配方和冷冻干燥工艺。在最终的优化参数条件下,针对RNA类靶标进行检测的冻干qPCR试剂可在常温保存569d,在37℃、56℃和80℃分别保存99d、6d和1 d;针对DNA类靶标进行检测的冻干qPCR试剂可在常温保存617 d,在37℃、56℃和80℃分别保存617 d、26 d和21 d。不仅如此,该优化后冻干系统可被应用于含有不同荧光基团标记探针（FAM、HEX、ROX、CY5和CY5.5）和针对不同靶标（病毒、细菌、细胞）进行检测的多种qPCR体系,具有通用性。此外,本文基于研究结果进一步阐明了在长期保存过程中影响冻干qPCR试剂活性的关键性因素,如生物活性原料热稳定性、所选冻干添加剂性质、qPCR试剂甘油含量、冻干制品水分残留度和保存温度等,对其进行深入研究有利于延长冻干qPCR试剂的贮存期。综上所述,本研究成功建立了可以使qPCR试剂在常温下保存1-2年的通用性冻干方法,阐明了冻干qPCR试剂在长期保存过程中活性维持的关键性因素。本研究成果有利于从操作上对核酸检测进行简化,从保存上使核酸检测试剂摆脱温度限制,从应用上同时为中心实验室及资源有限地区核酸检测的开展提供便利。
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