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柑橘是世界上最重要的水果之一。据FAO统计,现有138个国家栽培柑橘,面积接近700万公顷,总产1亿余吨,约占世界水果总产的22%,是仅次于小麦和玉米的第三大国际贸易农产品。2008年,我国柑橘面积203.08万公顷,产量2331.3万吨,居世界之首。自然状态下,柑橘芽变频率高,因此芽变育种是柑橘育种的一种重要方式。目前生产上栽培的主要柑橘品种,大多来自芽变育种。
现今有关柑橘芽变机理的研究,多从DNA或RNA水平进行探讨,而从蛋白质水平上探讨柑橘芽变机理的研究少有报道。本研究利用蛋白质组学技术,以春甜橘(Citrus reticulata Blanco cv.Chuntianju,野生型,WT)及其芽变品种明柳甜橘(Citrus reticulata Blanco cv.Mingliutianju,突变型,MT)为实验材料,采用蛋白质双向电泳技术(2-DE),力图从蛋白水平上探讨柑橘芽变机理,获得主要结果如下:
1.比较了Tris-HCl提取法、尿素/硫脲提取法、三氯乙酸/丙酮沉淀法、酚抽提法四种不同的蛋白提取方法,通过对比蛋白的产率、单向SDS-PAGE和2-DE效果,结果表明三氯乙酸/丙酮沉淀法(TCA)比较适合于柑橘叶片、果皮的蛋白提取。
2.采用双向电泳技术,获得了春甜橘和明柳甜橘叶片和果皮的清晰的2-DE凝胶电泳图谱。并且在野生型和突变型果皮的2-DE凝胶银染图谱上均可以重复检测到1200多个蛋白点。相对于野生型,在突变体果皮发现7个明显上调蛋白点,明显下调蛋白点13个。叶片中明显上调蛋白点12个,明显下调的蛋白点4个。
3.采用MALDI-TOF/TOF-MS对果皮差异蛋白进行质谱鉴定,共鉴定出15个差异蛋白。通过对质谱鉴定的15个差异蛋白设计基因特异性引物,进行PCR扩增,得到了6个差异蛋白对应的基因序列。相对于野生型,突变体明显上调的有Chitinase,Rubisco activase[Cucumis sativus];下调的:有ASR (ABA-water stress-ripening-induced protein), Miraculin-like protein 2,Putative miraculin-like protein 2,Rubisco activase[Malus domestica]。文献表明这些蛋白可能参与了防御应答、胁迫响应、光合作用、糖类和能量代谢等过程。
4.用半定量RT-PCR进一步验证了果皮差异蛋白在mRNA水平的变化情况。结果如下:Chitinase(spot 14)、ASR(spot 06)、Putative miraculin-like protein 2(spot 10)的RT-PCR结果与2-DE的电泳图谱分析结果一致;而Rubisco activase[Cucumis sativus](spot 11)与2-DE的电泳图谱分析结果刚好相反。Miraculin-like protein 2(spot 05)在野生型与突变型的表达量没有明显差异。
5.通过KOBAS在线功能分析系统对质谱鉴定的差异表达蛋白质进行信号通路分析,其中4个差异蛋白质存在9条信号通路。这些信号通路分别是:类黄酮生物合成、光合作用固碳途径、果糖和甘露糖代谢途径、糖酵解/糖原异生途径和氨基糖与核糖代谢途径等,这些代谢途径可能与柑橘芽变相关。