【摘 要】
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目的:制备金丝桃苷混合纳米胶束（Hyp-F127/TPGS）并优化其制备工艺。同时基于肠道菌群和血清脂质组学方法,探讨Hyp-F127/TPGS对高脂饮食诱导的载脂蛋白E基因敲除(Apo E-/-)小鼠的影响,并分析其治疗动脉粥样硬化（AS）的潜在作用机制。方法:采用薄膜分散法制备Hyp-F127/TPGS。在单因素实验和Plackett-Burman实验设计的基础上,结合Box-Behnken响
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目的:制备金丝桃苷混合纳米胶束（Hyp-F127/TPGS）并优化其制备工艺。同时基于肠道菌群和血清脂质组学方法,探讨Hyp-F127/TPGS对高脂饮食诱导的载脂蛋白E基因敲除(Apo E-/-)小鼠的影响,并分析其治疗动脉粥样硬化（AS）的潜在作用机制。方法:采用薄膜分散法制备Hyp-F127/TPGS。在单因素实验和Plackett-Burman实验设计的基础上,结合Box-Behnken响应面法,以包封率和载药量为考察指标,以F127-TPGS比例、水化时间、Hyp投药量为因素,优化其制备工艺并验证。同时,将48只8周龄雄性Apo E-/-小鼠随机分为模型组、瑞舒伐他汀组(10 mg·kg-1)、金丝桃苷高低剂量组(50、25 mg·kg-1)和同等剂量的Hyp-F127/TPGS高低剂量组,每组8只。8只C57BL/6小鼠作为空白组。连续给药8周后,采集各组小鼠血清测定其血脂水平并进行血清脂质组学分析;采用酶联免疫吸附测定法（ELISA）检测小鼠血清中相关因子水平;利用苏木素-伊红（HE）染色法观察小鼠主动脉病理形态;采集各组小鼠盲肠内容物,进行16S r RNA扩增子测序检测其肠道菌群变化,并将其与血清脂质组学进行联合分析探讨肠道菌群与差异代谢物之间相关性;运用免疫组化检测血管组织中IκBα、P-IκBα、P-IKKβ和P-NF-κB（p65）蛋白表达。结果:Hyp-F127/TPGS的最优制备工艺为:F127-TPGS比例2∶1、水化时间2 h、Hyp投药量9 mg;3次验证实验结果显示,所制Hyp-F127/TPGS的包封率为（87.20±0.99）%,载药量为（5.02±1.20）%,与预测值的偏差分别为0.92%和2.39%。按最优工艺所制胶束为黄色澄清透明溶液,具良好的丁达尔现象;透射电子显微镜下呈球形,形态完整且分布均匀,粒径为（15.02±0.16）nm,PDI为（0.092±0.031）,Zeta电位为（-6.67±1.47）m V;F127/TPGS的临界胶束浓度为21μg·m L-1,4℃下存放4周的稳定性良好;Hyp-F127/TPGS和Hyp对照品的累积释放率分别为（66.30±2.93）%（96 h）、（99.24±0.27）%（60 h）。药效学结果显示,与空白组相比,AS小鼠主动脉斑块面积显著增加并伴有炎性浸润,总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）水平显著升高（P＜0.01）,高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）水平显著降低（P＜0.01）,增加炎症因子和i NOS水平,降低e NOS、SOD、CAT和GSH水平。给予Hyp-F127/TPGS后,能显著缓解AS症状且恢复血脂异常现象。肠道菌群结果显示,Hyp-F127/TPGS干预后,能够降低AS小鼠致病菌相对丰度,升高有益菌相对丰度,改善AS小鼠肠道菌群结构紊乱现象。血清脂质组学结果显示,AS小鼠血清中多种脂质代谢物发生代谢紊乱,具体表现为磷脂酰胆碱（PC）出现明显下调,鞘磷脂（SM）、胆固醇酯（CE）、TG出现明显上调,Hyp-F127/TPGS能够使其趋于正常水平。联合分析结果表明,Hyp-F127/TPG主要通过改善厚壁菌门、变形菌门、拟杆菌门等菌群结构,进而调节PC、CE、SM、TG等脂质水平。代谢通路分析结果显示,这些代谢物主要的代谢途径为胆固醇代谢。免疫组化结果显示,Hyp-F127/TPGS治疗AS的作用机制可能通过上调IκBα蛋白表达,显著下调P-IκBα、P-IKKβ和P-NF-κB的核p65亚基表达（P＜0.05,P＜0.01）,从而减轻炎症损伤。结论:优化后的Hyp-F127/TPGS制备工艺稳定可行,能够显著调控肠道菌群及脂质代谢,抑制炎症反应,其作用机制可能与抑制NF-κB信号通路的激活,降低炎症因子水平,改善菌群结构紊乱和血脂异常状态有关,进而发挥抗AS作用。本课题进一步为金丝桃苷新剂型的研发和临床应用提供理论依据。
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