论文部分内容阅读
目的:本研究旨在探讨外源性Tregs细胞是否以剂量依赖的方式进入小鼠动脉硬化斑块进而稳定粥样硬化斑块并减轻动脉粥样硬化的发生及发展,探讨在动脉粥样硬化中Tregs细胞诱导M1巨噬细胞向M2巨噬细胞极化降低动脉粥样硬化发展的作用研究,为治疗动脉粥样硬化斑块提供一个新的方法以及思路。方法:本次实验一共分为体内实验和体外实验两个部分;1.体外实验:首先获得骨髓来源巨噬细胞M0,通过LPS（100ng/ml）+IFN-y（10ng/ml）干预24h诱导产生M1巨噬细胞,再通过磁珠分选从C57BL/6J小鼠脾脏中得到目的细胞Tregs细胞,将Tregs细胞与M1巨噬细胞Transwell共培养,并随机将其分为5组:control组、CD4+CD25-T细胞组（1x10~6）、小剂量Tregs组（1x10~5）、中剂量Tregs组（5x10~5）、大剂量Tregs组（1x10~6）,共培养24h后对其进行免疫荧光检测观察M2巨噬细胞表达情况,并收集细胞上清液通过ELISA法检测TGF-β1和IL-10浓度水平。2.体内实验:选取50只8周龄Apo E-/-小鼠高脂喂养4周后对其进行颈动脉串联结扎,继续高脂喂养4周,将Apo E-/-小鼠随机分为5组分别进行尾静脉注射:NS组（n=10 200μl生理盐水）、CD4+CD25-T细胞组（n=10 CD4+CD25-T 1x10~6）、小剂量Tregs组（n=10 1x10~5Tregs）、中剂量Tregs组（n=10 5x10~5 Tregs）、大剂量Tregs组（n=10 1x10~6 Tregs）;每两周注射1次,共注射2次,收集标本制备右侧颈动脉切片,对颈动脉粥样硬化斑块进行HE染色观察斑块稳定性;留取主动脉分别进行油红0染色、Weste1rn Blot和RT-PCR,观察动脉粥样硬化进展的情况,以及动脉硬化斑块中Foxp3、M1巨噬细胞（i NOS）、M2巨噬细胞（Arg-1、CD206）蛋白和m RNA的表达水平;收集Apo E-/-小鼠血清使用ELISA法检测IL-10和TGF-β1浓度水平。结果:1.细胞提取及培养:骨髓来源的巨噬细胞培养第5天免疫荧光和流式检测,97%以上的单核细胞转化为M0巨噬细胞;M0经LPS（100ng/ml）+IFN-y（10ng/ml）刺激24h,免疫荧光双染和流式检测,98%以上的M0巨噬细胞转化为M1巨噬细胞;磁珠分选Treg细胞培养扩增7天,对Treg细胞进行流式检测,可观察到Treg细胞明显扩增并且表型未发生改变;2.Transwell共培养:不同浓度Treg细胞与M1巨噬细胞Transwell共培养24h,免疫荧光检测可见大剂量组M1巨噬细胞基本全部转化为M2巨噬细胞,中剂量组部分转化,小剂量组转化为M2巨噬细胞较少,而NS组和CD4+CD25-T细胞组基本没有转化（P＜0.05）。3.HE染色:NS组、CD4+CD25-T细胞组和小剂量Tregs组颈动脉动脉粥样硬化斑块面积大于大剂量组和中剂量组的颈动脉斑块面积,并且NS组和CD4+CD25-T细胞组斑块出现破裂,中剂量组和大剂量组斑块较为完整趋于稳定。4.油红0染色:大剂量组、中剂量组和小剂量组动脉粥样硬化程度远远低于NS组和CD4+CD25-T细胞组,同时可以观察到大剂量组动脉粥样硬化程度又远远低于中剂量组和小剂量组。5.Western Blot:体内实验中,大剂量组和中剂量组较NS组、CD4+CD25-T组和小剂量组Foxp3的蛋白表达明显增加（P＜0.05）;M1巨噬细胞特异性抗体i NOS蛋白的表达在中剂量组和大剂量组较NS组、CD4+CD25-T组和小剂量组明显减少（P＜0.05）;相反在各组斑块中M2巨噬细胞特异性抗体Arg-1和CD206蛋白表达在中剂量组和大剂量组较NS组、CD4+CD25-T组和小剂量组明显增加（P＜0.05）。6.RT-PCR:体内实验中,大剂量组和中剂量组Foxp3、Arg-1和CD206 m RNA表达较NS组、CD4+CD25-T组和小剂量明显增加（P＜0.05）;而大剂量Tregs组和中剂量Tregs组i NOS m RNA表达较NS组、CD4+CD25-T组和小剂量明显减少（P＜0.05）。7.ELISA检测:体外实验,共培养细胞上清液中IL-10和TGF-β1的浓度在大剂量组和中剂量组比control组、CD4+CD25-T细胞组和小剂量组明显增多（P＜0.05）;体外实验,小鼠血清中IL-10和TGF-β1的浓度在大剂量组和中剂量组较control组、CD4+CD25-T细胞组和小剂量组也是明显增多（P＜0.05）。结论:1.在Apo E-/-小鼠颈动脉易损斑块模型中,Tregs细胞以剂量依赖的方式进入小鼠颈动脉斑块进而稳定易损斑块并减轻动脉粥样硬化的发生及发展。2.在动脉粥样硬化中,Treg细胞能够诱导斑块中M1巨噬细胞向M2巨噬细胞极化,降低动脉粥样硬化发展。3.Tregs细胞是通过依赖自身分泌的IL-10和TGF-β1诱导巨噬细胞极化。