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COX-2(Cyclooxygenase-2)是催化花生四烯酸转化为前列腺素类物质的关键限速酶,它参与了机体的许多病理生理过程,如促进肿瘤的发生发展,促进血管生成,促进炎症进程,增强肿瘤细胞的耐药性等。因此,COX-2已经成为肿瘤治疗的靶点。由于针对COX-2的抑制剂在临床应用中会有严重的毒副作用,所以亟待建立以COX-2为靶点的靶向、安全、高效的肿瘤治疗的新策略。而单链抗体凭借其高亲和力、高特异性、组织穿透力强、免疫原性小等优点,已经在临床上以多种形式被应用,在肿瘤诊断和治疗中具有独特的优势。本实验室在前期研究的基础上,已经成功制备了能在体内外特异性结合COX-2,并抑制其生物学活性的人源单链抗体,内质网滞留型的抗COX-2胞内单链抗体有效抑制肿瘤细胞的生长增殖、迁移、体外侵袭能力,并且能够促进肿瘤细胞的凋亡。但是对于抗COX-2单链抗体与COX-2分子间相互识别、相互作用的分子机制尚不清楚。因此本研究利用噬菌体环七肽库筛选技术、同源建模与分子对接等方法对COX-2和单链抗体之间的相互作用关键位点进行预测分析,主要结果如下:1.我们利用大肠杆菌BL21和HB2151分别成功表达纯化了纯度达95%以上的具有较好活性的COX-2和抗COX-2单链抗体;2.温度梯度ELISA实验发现,COX-2与抗COX-2人源单链抗体的结合活性随着处理COX-2的温度升高而下降,当温度达到100℃时,抗原蛋白完全丧失了与抗体结合的活性,这说明100℃时,COX-2蛋白的空间构象已经完全被破坏,不再具有与单链抗体结合的能力,进而表明抗COX-2人源单链抗体识别的COX-2的表位为构象表位;3.以抗COX-2人源单链抗体为靶蛋白,经过连续4轮的环七肽库筛选,获得了 36个能够与抗COX-2人源单链抗体蛋白特异性结合的噬菌斑克隆。将36个克隆的DNA连入pMD-18T载体中,通过测序,共得到了 19个有效小肽序列;4.小肽序列经分析得到三个模拟位(KRTMREN、PGA和TSKG),发现三个模拟位分别与COX-2上的511-537、514-527和521-533位氨基酸具有高度的同源性。鉴于这些模拟位在位置上具有部分重合,我们根据这些模拟位得出模拟表位肽序列KRPTMEGASKGN,这个基序与COX-2上511-537位的氨基酸具有高度同源性。所以我们推测,KRPTMEGASKGN可能参与COX-2的表位形成,在抗COX-2单链抗体与COX-2相互识别中发挥重要作用;5.小肽的同源建模及与单链抗体的分子对接实验表明,部分小肽能够与单链抗体的VH和VL的CDR区93-98、160-162、182-186、228-232位氨基酸结合,而这些小肽序列中包含了我们筛选到的三组基序,这进一步支持了我们筛选的模拟表位KRPTMEGASKGN可能参与COX-2的表位形成的推测;6.将模拟表位肽基序与COX-2酶活性部位的关键氨基酸进行比对发现,我们获得的模拟表位肽序列中包含COX-2酶活性关键部位上的部分氨基酸,因此我们推测抗COX-2人源单链抗体通过与这些关键位点相互作用,进而抑制COX-2的活性。综上所述,我们通过噬菌体环七肽库筛选结合计算机模拟方法预测了 COX-2与单链抗体相互作用的表位,初步推测抗COX-2单链抗体抑制COX-2功能的可能机制,这为以COX-2为靶点的抗体肿瘤治疗奠定了分子基础。