论文部分内容阅读
背景:镉(Cadmium)是一种常见的有毒重金属,通过饮食和呼吸摄入体内,可在多个器官蓄积。短期大量接触Cd或长期摄入含Cd的物质均对机体造成严重的危害。Cd的直接暴露对肝、肾、睾丸、肺和大脑等器官都会产生毒理损伤,该领域的研究也取得了一定的进展,但母代Cd暴露对子代中枢神经系统损伤的详细机理尚不明确。本课题组前期研究发现:母代孕期及哺乳期Cd暴露后,雄性子代海马组织的磷脂酶PLCβ4呈现异常高表达,BDNF作为重要的神经营养因子,外源加入能够逆转Cd对海马神经元中PLCβ4的上调,提示PLCβ4与BDNF存在相互调节作用。此外,PLCβ4的同工酶PLCβ1也广泛参与中枢神经生长发育的调控。目前针对胎儿及幼儿Cd暴露损害大脑发育的研究还只是停留在表观流行病学上,涉及的靶点及分子机制鲜有报道。阐明母代Cd暴露损害子代中枢神经系统发育的分子机制,对拓展儿童学习记忆功能损害研究的相关实验室数据和理论依据具有重要意义。目的:明确磷脂酶PLCβ4/1参与母代Cd暴露损害雄性子代学习记忆能力的分子机制,探讨Cd下调雄性子代海马组织中PLCβ1,上调PLCβ4蛋白的作用机制。方法:将性成熟的SD雌性大鼠和雄性大鼠按1:1或1:2的比例合笼交配3-4 d,确认雌鼠交配成功后,将雌鼠随机分为空白组(Ctrl:0.9%生理盐水)、低剂量组(Cd1:1 mg/kg)和高剂量组(Cd5:5 mg/kg),每天上午9:00给雌性大鼠灌胃给药一次,并每周称重,按体重确定给药量,给药时间一直持续到孕鼠哺乳期结束。分别在子代雄鼠出生后(Postnatal,PND)21天、35天和56天麻醉后灌注,准确分离皮质和海马,心脏穿刺取血,一部分海马皮质用多聚甲醛固定制备冰冻切片,另一部分迅速置于-80℃冰箱冻存。子代大鼠PND 35和PND 56时,对其进行Y迷宫行为学实验;在雄性子代老年时,对其进行水迷宫行为学实验,评价雄性子代学习记忆功能的受损情况;同时对其海马CA1区进行核磁共振扩散峰度成像(Magnetic resonance imaging-Diffusion Kurtosis Imaging,MRI-DKI),评价组织复杂度和神经元丢失情况。在PND 21、PND 35和PND 56的雄性子一代海马中,WB测定PLCβ4﹑孕酮膜受体PGRMC1和BDNF的蛋白表达水平;运用液相质谱联用仪(Liquid chromatograph-mass spectrometer,LC-MS)测定内源性大麻素2-AG的含量,WB测定内源性大麻素逆行性通路mGlu R5/PLCβ1/DGLα/中各蛋白分子的表达水平。在老年雄性子一代中,WB测定海马组织中内源性大麻素逆行性通路mGlu R5/PLCβ1/DGLα中各蛋白分子的表达水平,WB测定各个发育时期的PLCβ4、PGRMC1和BDNF的蛋白表达水平和BDNF效应通路中Trkβ蛋白及其磷酸化水平。体外实验:取刚出生24 h的雄性SD乳鼠,在无菌操作台中于冰上迅速准确分离海马,然后剪碎消化组织获得海马神经元,使用Neurobasal+2%B27培养基培养雄性大鼠原代海马神经元。然后在37℃培养箱培养至第5天给予Cd暴露,浓度梯度分别为:2μM、4μM和6μM。24 h后收取细胞提蛋白,WB测定神经元中mGlu R5、PLCβ1和DGLα蛋白分子的表达水平;使用si RNA干扰技术敲低PC12细胞株和海马神经元中PLCβ4蛋白的表达水平,WB测定细胞中PGRMC1、BDNF和PLCβ4的蛋白表达水平。在海马神经元中外源加入孕酮(P4)和一定浓度的Cd(2μM),WB测定细胞中PGRMC1、BDNF和PLCβ4的蛋白表达水平。结果:1.Y迷宫实验中,在青年期(PND 35)时,与对照组相比较,Cd1组和Cd5组的自主交替率显著下降(P<0.01);在成年期(PND 56)时,与对照组相比较,Cd1组和Cd5组的自主交替率也显著下降(P<0.001)。2.在Morris水迷宫实验中,雄性子一代在老年时,与Ctrl组相比较,Cd5组的逃避潜伏期显著延长(P<0.05),穿越平台次数上也显著减少(P<0.05)。3.在老年雄性子代MRI-DKI图像中,Cd5组对比Ctrl组,水分子平均弥散率(Diffusion Kurtosis Imaging-Mean diffusivity,DKI-MD)数值显著增大,在Pearson’s相关性检验中,水迷宫的逃避潜伏期和DKI-MD呈高度正相关关系(r=0.9783,P<0.0001);而水分子平均扩散峰度(Diffusion Kurtosis Imaging-Mean kurtosis,DKI-MK)数值则显著降低,且和水迷宫中逃避潜伏期呈高度负相关关系(r=-0.9708,P<0.0003)。4.与相应年龄段的Ctrl组比较,雄性子一代在PND 21时,Cd5组的PLCβ4蛋白表达水平显著上调(P<0.05),MMP9、PGRMC1和BDNF蛋白表达水平均显著下调(P<0.05);雄性子一代在PND 35时,Cd1组和Cd5组的PLCβ4蛋白表达水平显著上调(P<0.01),Cd5组的MMP9、PGRMC1和BDNF蛋白表达水平均显著下调(P<0.05),Cd1组的BDNF蛋白表达水平显著下调(P<0.01);雄性子一代在PND 56时,Cd5组PLCβ4蛋白表达水平显著上调(P<0.05),Cd1组的MMP9、PGRMC1和BDNF蛋白表达水平均显著下调(P<0.05);Cd5组的MMP9、PGRMC1和BDNF蛋白表达水平均显著下调(P<0.05);雄性子一代在老年时,Cd5组的PLCβ4蛋白表达水平显著上调(P<0.05),MMP9、PGRMC1、BDNF、p-Trkβ和Trkβ蛋白表达水平均显著下调(P<0.05),Cd1组的p-Trkβ蛋白表达水平显著下调(P<0.001)。5.在PC12细胞株的si RNA干扰实验中,PLCβ4沉默后给予Cd(Cd:4μM)处理,4μM组的PLCβ4蛋白表达水平显著上调(P<0.01),而BDNF蛋白表达水平显著下调(P<0.05);与4μM组相比较,4μM+si组和si组的PLCβ4蛋白表达水平显著下调(P<0.001),而BDNF蛋白表达水平却显著上调(P<0.001)。在海马神经元中沉默PLCβ4后给予Cd处理(Cd:2μM),与2μM组相比较,2μM+si组和si组的PLCβ4蛋白表达水平显著下调(P<0.001),而PGRMC1蛋白表达水平却显著上调(P<0.05,P<0.001),BDNF蛋白表达水平也显著上调(P<0.01,P<0.001)。6.在雄性海马神经元的si RNA干扰实验中,PGRMC1沉默后,与阴性对照组(Negative Control,NC)相比较,si-634组的PGRMC1、MMP9和BDNF的蛋白表达水平显著下调(P<0.01,P<0.01,P<0.05),而PLCβ4的蛋白表达水平显著上调(P<0.05)。7.海马神经元接受Cd暴露的同时给予孕酮(P4)一起处理,与单纯Cd暴露组(Cd:2μM)相比较,2μM+P1组(P1:孕酮1 n M)、2μM+P3组(P3:孕酮3 n M)和2μM+P9组(P9:孕酮9 n M)细胞中PLCβ4的蛋白表达水平均显著下调(P<0.01,P<0.001,P<0.001),而PGRMC1的蛋白表达水平均显著上调(P<0.05,P<0.01,P<0.01),同时BDNF的蛋白表达水平也显著上调(P<0.01,P<0.05,P<0.001)。8.液相质谱测定海马中2-AG含量,与相应年龄段的Ctrl组比较,雄性子一代在幼儿期(PND 21)时,Cd1组和Cd5组海马中的内源性大麻素2-AG的含量无明显变化;在青年期(PND 35)时,Cd5组海马中的内源性大麻素2-AG含量显著下降(P<0.001);在成年期(PND 56)时,Cd1组和Cd5组海马中的内源性大麻素2-AG含量均显著下降(P<0.001,P<0.05)。9.与相应年龄段的Ctrl组比较,雄性子一代在PND 21时,Cd5组的mGlu R5、PLCβ1和DGLα的蛋白表达水平显著下调(P<0.05);雄性子一代在PND 35和PND56时,Cd1组和Cd5组的mGlu R5、PLCβ1和DGLα的蛋白表达水平表达均显著下调(P<0.05);雄性子一代在老年时,Cd5组的mGlu R5、PLCβ1和DGLα蛋白表达水平也显著下调(P<0.05)。10.当海马神经元接受Cd暴露后,与对照组相比较,4μM组和6μM组细胞的内源性大麻素2-AG生成通路的关键分子mGlu R5、PLCβ1和DGLα都呈显著下调(P<0.01)。结论:(1)母体孕期和哺乳期Cd暴露,能够长期并且不可逆的损害雄性子代各个发育时期的学习记忆功能,而且这种损伤效应一直持续到老年期。(2)Cd通过靶向上调PLCβ4进而负向调控孕酮介导的BDNF生成通路PGRMC1/BDNF,最终减少海马中BDNF的生成;同时BDNF能够负反馈调控PLCβ4蛋白的表达水平,PLCβ4和BDNF存在相互调节的关系。(3)母体孕期和哺乳期Cd暴露后,在雄性子一代中,Cd通过负向调控内源性大麻素2-AG生成信号通路mGlu R5/PLCβ1/DGLα,进而减少海马中2-AG的生成,并最终损害雄性子一代的学习记忆功能。