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牛病毒性腹泻病毒（Bovine viral diarrhea virus,BVDV）是牛病毒性腹泻病（Bovine virus diarrhea,BVD）的病原体,与边界病病毒（Border disease virus,BDV）和经典猪瘟病毒（Classical swine fever virus,CSFV）同属于瘟病毒属。BVDV感染会引起呼吸系统、消化系统、生殖系统、免疫系统等多个系统疾病,对养牛业造成重大经济损失。细胞周期是细胞复制过程,一经启动便可有序进行。研究表明,病毒感染后会通过调控细胞周期的变化为病毒增殖创造有利环境。本研究以不同生物型BVDV毒株感染MDBK细胞,探索致细胞病变型和非致细胞病变型毒株对细胞周期阻滞的影响。1.BVDV感染诱导MDBK细胞周期阻滞分别使用BVDV TC株和NADL株感染MDBK细胞,NADL株感染可产生病变为致细胞病变型（Cytopathic,CP）,而TC株感染未见病变为非致细胞病变型（Noncytopathic,NCP）。经IFA,观察两株病毒感染的细胞质均呈现特异性绿色荧光,表明这两株病毒均可在MDBK细胞中增殖。CCK-8试验确定试验感染剂量为1 MOI。为了深入了解细胞病毒感染过程与细胞周期的关系,分别使用BVDV NADL株和TC株感染MDBK细胞,于12h、24 h、36 h、48 h收集细胞,PI染色后通过流式细胞术检测细胞周期各时相分布情况,TC株（NCP）感染诱导MDBK细胞阻滞在S期,NADL株（CP）感染诱导细胞阻滞在G0/G1期。同步化处理结果同异步化。2.BVDV NADL株和TC株经p53引起细胞周期阻滞为探究这不同生物型BVDV感染对细胞周期阻滞的影响。分别提取感染病毒细胞总RNA和蛋白质,通过实时荧光定量PCR和Western blot检测G0/G1期和G1/S期相关细胞周期蛋白Cyclin D1、Cyclin E2和细胞周期蛋白依赖性激酶CDK2、CDK4、CDK6,p53通路中ATM、p53、p21、p-p53（Ser-15）,GAPDH作为内参。结果显示,TC株（NCP）感染后CDK4、CDK6、Cyclin D1、Cyclin E2、CDK2、ATM、p53、p21基因的mRNA表达水平升高,Cyclin E2 mRNA表达明显降低;CDK2、CDK4、Cyclin D1和p21感染后蛋白表达水平降低,CDK6、Cyclin E2、p53、p-p53（Ser-15）蛋白表达水平升高。NADL株（CP）感染后除ATM mRNA表达水平无差异外,其它基因mRNA表达水平同TC株;在蛋白表达水平上,仅CDK4蛋白表达量升高。为明确BVDV引起的细胞周期阻滞与p53通路关系,使用p53抑制剂处理细胞,通过流式细胞术检测细胞周期,发现抑制剂处理后可以减少TC株（NCP）对S期及NADL株（CP）对G0/G1期的阻滞;通过Western blot检测细胞周期蛋白p53和p-p53（Ser-15）,发现抑制剂处理后蛋白几乎不表达。3.BVDV诱导细胞周期阻滞对病毒复制的影响为探究细胞周期阻滞对BVDV复制的影响。分别通过血清饥饿法、胸苷法和诺考达唑处理将细胞周期同步化在G0/G1期、G1/S期、G2/M期的细胞,以非同步化细胞作为对照。使用1 MOI病毒分别感染同步化和非同步化细胞,感染48 h后通过实时荧光定量PCR检测BVDV 5’-UTR的mRNA水平,IPMA测定病毒TCID50,流式细胞术检测细胞周期时相分布,结果发现G0/G1期促进NADL株（NCP）复制,对TC株（NCP）复制具有抑制作用;G1/S期促进TC株（NCP）和NADL株（CP）复制;G2/M期促进TC株（NCP）复制,对NADL株（CP）复制具有抑制作用。综上所述,本研究通过对不同生物型的BVDV感染对MDBK细胞周期阻滞的影响,明确TC株（NCP）感染诱导MDBK细胞阻滞在S期,NADL株（CP）感染诱导细胞阻滞在G0/G1期,不同生物型BVDV均可通过p53通路引起细胞周期的阻滞,G0/G1期促进NADL株（CP）复制,G1/S期促进TC株（NCP）和NADL株（CP）复制;G2/M期促进TC（NCP）株复制,证实了细胞周期阻滞有利于其在细胞内增殖。