【摘 要】
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羊无浆体(Anaplasma ovis)感染绵羊、山羊和一些野生反刍动物,引起无浆体病。主要表面蛋白(Major Surface Proteins,MSPs)是其外膜蛋白,也是重要抗原。为分析其持续感染过程
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羊无浆体(Anaplasma ovis)感染绵羊、山羊和一些野生反刍动物,引起无浆体病。主要表面蛋白(Major Surface Proteins,MSPs)是其外膜蛋白,也是重要抗原。为分析其持续感染过程中,外膜蛋白的抗原变异特征,本研究进行了:1.羊无浆体持续感染绵羊模型的构建。静脉注射羊无浆体阳性菌血(海北株),人工感染三只健康绵羊(编106~#、134~#、174~#)。接种后一年内,定期采血,经涂片镜检、PCR检测(靶标msp4基因,869bp目的片段)和间接ELISA检测,成功构建了羊无浆体持续感染绵羊模型。2.羊无浆体MSP1a蛋白的抗原变异分析。用artemis软件对本实验室测序的羊无浆体海北株全基因组进行序列分析,发现其msp1a基因存在末端重复。据其序列设计引物AoMsp1a(F3/R3),以不同时间点全血DNA为模板(模型羊持续感染1年内,用间接ELISA检测抗体水平,选择在抗体曲线拐点处的基因组样品),扩增得到10个msp1a末端重复序列,长度883bp,克隆至pGEM-T easy载体,转化E.coli(DH5α),涂布培养、挑单菌落扩大培养后提取质粒测序。将10个msp1a序列翻译后进行氨基酸序列比对分析。所有msp1a基因序列同源性>99%,末端重复氨基酸序列总长度为197氨基酸,其结构分为4个区段:3个完全一致的重复区段(55个氨基酸)和1个32氨基酸区段,且与原始感染菌株的蛋白序列一致。结论:在实验性持续感染模型绵羊中,羊无浆体MSP1a蛋白序列和结构保持稳定。3.羊无浆体MSP2蛋白高变区(Hypervariable region,HVR)抗原变异分析。对本实验室测序的羊无浆体海北株全基因组数据进行比对分析,发现msp2基因家族包含1条全长表达序列及5条同源基因,所有同源基因均包含HVR序列。针对msp2表达序列HVR设计套式PCR引物lzn111(F/R)和lzn22(F/R),扩增10个不同时间点样品的msp2高变区,最终获得长度457bp的目的片段,克隆至pGEM-T easy质粒,转化E.coli(JM109),涂布培养挑取单菌落扩大培养后提取质粒测序。每个时间点样品测序得到10-15条序列,共得到130条HVR序列。翻译为氨基酸序列进行比对分析发现,MSP2高变区包含2个高变微区,由3个保守序列隔开。高变微区在持续感染过程中,通过msp2表达位点与同源假基因高变区编码序列之间的基因重组产生抗原变异,并且序列多样性不断增加。结论:MSP2蛋白高变区编码序列在羊无浆体持续感染过程发生持续序列变异。
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