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目的:
胆道闭锁(Biliary atresia,BA)是一种以胆管炎和纤维化梗阻为特征的严重肝病,是小儿肝移植最为常见的适应症。BA的病因尚未明确,但众多研究支持病毒感染胆管上皮细胞并激活自身攻击性免疫应答的致病机制。自身抗体存在于许多自身免疫性疾病中,并可能主要作为自身免疫应答的标志物。尽管如此,关于BA血清抗体筛查的研究却非常少见,且缺乏血清学诊断标准。因此,本研究通过对BA患儿血清多种自身抗体的检测,观察抗体在患儿不同年龄段、肝纤维化不同分期的分布特点和变化规律,评估差异性抗体在BA致病机制、鉴别诊断和预后预测的价值。
方法:
1.自身抗体筛查:对Ⅲ型胆道闭锁(BA)患儿血清样本208例,含Kasai术前124例,Kasai术后84例,疾病对照组(DC)92例,正常对照组(NC)48例进行以下抗体筛查。间接免疫荧光法检测抗核抗体(ANA)和抗中性粒细胞胞浆抗体(ANCA),线性斑点印迹法检测自身免疫性肝病相关抗体(原发性胆汁性胆管炎PBC相关抗体:抗线粒体M2亚型抗体AMA-M2、抗三联体抗体M2-3E、抗核点状蛋白100抗体Sp100、抗早幼粒细胞白血病蛋白抗体PML、抗核膜糖蛋白210抗体gp210;自身免疫性肝炎AIH相关抗体:抗肝肾微粒体1型抗体LKM-1、抗肝溶质抗原1型抗体LC-1、抗可溶性肝抗原/肝胰抗原抗体SLA/LP)和Ro-52抗体,酶联免疫吸附法检测抗纤维状肌动蛋白抗体(抗F-actin)。分析血清自身抗体在BA的检出情况。找出有统计学差异的自身抗体。
2.自身抗体特异性靶抗原鉴定:线性印迹法对ANA18项特异性靶抗原进行鉴定;ELISA法对ANCA的MPO/PR3特异性靶抗原进行鉴定;通过扩大样本量采用ELISA法对差异的抗M2-3E抗体进行验证。
3.差异自身抗体与临床关联性,病例随访结果分析:分析人巨细胞病毒感染与差异性自身抗体在BA血清中存在是否有关;根据Metavir评分系统对BA肝
活检组织进行肝纤维化分期,分析差异自身抗体与肝纤维化分期的关系;观察差异自身抗体在不同年龄段的分布和变化特点;对24例病例持续追踪,观察抗体水平变化规律,分析抗体与疾病预后等相关性。
结果:
1.ANA指标在BA组的总体阳性率为11.5%,术前术后的检出率相当,分别占11.3%(14/124)和11.9%(10/84),主要的荧光模型都集中在颗粒型和核仁型,BA与疾病对照组的检出率差异具有统计学意义(4.2%,P<0.05);ANCA指标在BA组的总体阳性率为27.9%,明显高于正常婴幼儿组(4.2%,P<0.05),其中术前高达29.0%,术后为26.2%,均以核周荧光模型为主,但与疾病对照组的检出率差异无统计学意义(25%,P>0.05);自身免疫性肝病相关抗体:BA组患儿中PBC相关抗体组合检出率为18.5%,单一检出率由高到低分别为抗M2-3E抗体(14.8%)、抗PML抗体(3.7%)、抗gp210抗体(2.5%),AMA-M2(1.2%)和抗sp100抗体(1.2%),其中,抗M2-3E抗体阳性率明显高于正常婴幼儿组(P<0.05),但与疾病对照组相比,无统计学差异(4.2%,P>0.05)。AIH相关抗体和抗Ro-52抗体在各组检出率均比较低,无统计学差异(P>0.05);抗F-actin在BA组阳性率达27.1%,与对照组的检出率差异有统计学意义(12.8%,P<0.05)。
2.ANA特异性靶抗原:18项ANA特异性靶抗原在BA组、疾病对照组以及正常对照组的检测率均较低,组间差异无统计学意义(8.2%&3.3%&2.1%,P>0.05)。其中BA针对的ANA特异性靶抗原主要为着丝点蛋白、Ro-52、dsDNA、SSA、组蛋白和核小体。ANA-IIF阳性者与靶抗原阳性者并非一一对应,与方法学存在检测范围、灵敏度与特异性差异有关。ANCA特异性靶抗原:在BA组中以MPO和PR3为靶抗原者有分别占12.5%和12.0%,其中有13例(6.5%)BA患儿MPO和PR3靶抗原同时阳性,任一阳性(MPO or/and PR3)占18.3%。而在DC组,以MPO和PR3为靶抗原者分别占6.5%和14.2%,任一阳性占14.2%,在NC组有2例MPO靶抗原为阳性,占4.2%。任一靶抗原(MPO or/and PR3)在BA组与正常对照组的阳性率差异有统计学意义(P<0.05),但BA组与疾病对照组的阳性率无统计学差异(P>0.05)。疾病对照组和正常对照组间尚未发现有统计学差异(P>0.05)。抗M2-3E抗体验证:通过扩大样本量,对检出率差异蛋白的验证,前后结果几乎一致。抗M2-3E抗体在BA术前或术后的检出率均明显高于疾病对照组和正常对照组,差异有统计学意义(术前25.8%&术后28.6%&8.6%&4.2%,P<0.05)。
3.差异性自身抗体与人巨细胞病毒:本研究中80例BA患儿在确诊前进行了人巨细胞病毒检测,其中36例(45%)存在人巨细胞病毒感染。ANCA相关抗体(ANCA-IIF/anti-MPO/anti-PR3)阳性者感染人巨细胞病毒率大于抗体阴性者,但感染率差异为统计学意义(P>0.05)。同样地,抗M2-3E抗体阳性者与阴性者的人巨细胞病毒感染率都差异也无统计学意义(51.9%&41.5%,P>0.05)。差异性自身抗体与BA肝纤维化程度:ANCA相关抗体在BA的F0-4级分别占50.0%,30.0%,41.7%,32.0%和44.4%,不同级别变化不明显;抗M2-3E抗体在F0-4级检出率分别占25.0%,27.0%,16.7%,32.0%和22.2%,不同级别的抗体阳性率波动也不明显。差异性抗体与BA肝纤维严重程度尚未发现相关性,无论肝纤维化程度严重与否,自身抗体都存在。差异抗体在不同年龄段分布:ANCA相关抗体/anti-M2-3E在BA组12个月龄前的阳性率保持在同一水平,到≥12月后才有相对下降的趋势。可见抗体在BA患儿血清中长期存在。随访病例分析:发现ANCA/anti-MPO/anti-PR3抗体与术后胆管炎发生存在关联性(P<0.05)。抗体持续阳性者,胆管炎发生率增高,抗体一直阴性者,术后发生胆管炎发生率低,抗体水平下降/转阴者,发生胆管炎率也下降。关于术后黄疸消退与ANCA/anti-MPO/anti-PR3的关系,未发现明显相关。抗M2-3E抗体在术后胆管炎发生和黄疸消退预测值也未见统计学意义(P>0.05)。
结论:
1.自身免疫现象在BA中普遍存在。尽管这些常见自身抗体缺乏BA疾病特异性,不能作为BA诊断以及鉴别诊断的指标,但高检出率的自身抗体提供了最为直接的证据,支持自身免疫参与BA致病机制。
2.ANCA相关抗体与BA术后胆管炎出现存在关联。
3.抗M2-3E抗体主要出现于成人,本研究首次发现抗M2-3E抗体在部分BA患儿血清中出现,其来源和预后判断价值仍待进一步研究。
4.抗体在BA患儿血清中长期存在,也许与BA免疫系统紊乱激活的病理病态有关。
胆道闭锁(Biliary atresia,BA)是一种以胆管炎和纤维化梗阻为特征的严重肝病,是小儿肝移植最为常见的适应症。BA的病因尚未明确,但众多研究支持病毒感染胆管上皮细胞并激活自身攻击性免疫应答的致病机制。自身抗体存在于许多自身免疫性疾病中,并可能主要作为自身免疫应答的标志物。尽管如此,关于BA血清抗体筛查的研究却非常少见,且缺乏血清学诊断标准。因此,本研究通过对BA患儿血清多种自身抗体的检测,观察抗体在患儿不同年龄段、肝纤维化不同分期的分布特点和变化规律,评估差异性抗体在BA致病机制、鉴别诊断和预后预测的价值。
方法:
1.自身抗体筛查:对Ⅲ型胆道闭锁(BA)患儿血清样本208例,含Kasai术前124例,Kasai术后84例,疾病对照组(DC)92例,正常对照组(NC)48例进行以下抗体筛查。间接免疫荧光法检测抗核抗体(ANA)和抗中性粒细胞胞浆抗体(ANCA),线性斑点印迹法检测自身免疫性肝病相关抗体(原发性胆汁性胆管炎PBC相关抗体:抗线粒体M2亚型抗体AMA-M2、抗三联体抗体M2-3E、抗核点状蛋白100抗体Sp100、抗早幼粒细胞白血病蛋白抗体PML、抗核膜糖蛋白210抗体gp210;自身免疫性肝炎AIH相关抗体:抗肝肾微粒体1型抗体LKM-1、抗肝溶质抗原1型抗体LC-1、抗可溶性肝抗原/肝胰抗原抗体SLA/LP)和Ro-52抗体,酶联免疫吸附法检测抗纤维状肌动蛋白抗体(抗F-actin)。分析血清自身抗体在BA的检出情况。找出有统计学差异的自身抗体。
2.自身抗体特异性靶抗原鉴定:线性印迹法对ANA18项特异性靶抗原进行鉴定;ELISA法对ANCA的MPO/PR3特异性靶抗原进行鉴定;通过扩大样本量采用ELISA法对差异的抗M2-3E抗体进行验证。
3.差异自身抗体与临床关联性,病例随访结果分析:分析人巨细胞病毒感染与差异性自身抗体在BA血清中存在是否有关;根据Metavir评分系统对BA肝
活检组织进行肝纤维化分期,分析差异自身抗体与肝纤维化分期的关系;观察差异自身抗体在不同年龄段的分布和变化特点;对24例病例持续追踪,观察抗体水平变化规律,分析抗体与疾病预后等相关性。
结果:
1.ANA指标在BA组的总体阳性率为11.5%,术前术后的检出率相当,分别占11.3%(14/124)和11.9%(10/84),主要的荧光模型都集中在颗粒型和核仁型,BA与疾病对照组的检出率差异具有统计学意义(4.2%,P<0.05);ANCA指标在BA组的总体阳性率为27.9%,明显高于正常婴幼儿组(4.2%,P<0.05),其中术前高达29.0%,术后为26.2%,均以核周荧光模型为主,但与疾病对照组的检出率差异无统计学意义(25%,P>0.05);自身免疫性肝病相关抗体:BA组患儿中PBC相关抗体组合检出率为18.5%,单一检出率由高到低分别为抗M2-3E抗体(14.8%)、抗PML抗体(3.7%)、抗gp210抗体(2.5%),AMA-M2(1.2%)和抗sp100抗体(1.2%),其中,抗M2-3E抗体阳性率明显高于正常婴幼儿组(P<0.05),但与疾病对照组相比,无统计学差异(4.2%,P>0.05)。AIH相关抗体和抗Ro-52抗体在各组检出率均比较低,无统计学差异(P>0.05);抗F-actin在BA组阳性率达27.1%,与对照组的检出率差异有统计学意义(12.8%,P<0.05)。
2.ANA特异性靶抗原:18项ANA特异性靶抗原在BA组、疾病对照组以及正常对照组的检测率均较低,组间差异无统计学意义(8.2%&3.3%&2.1%,P>0.05)。其中BA针对的ANA特异性靶抗原主要为着丝点蛋白、Ro-52、dsDNA、SSA、组蛋白和核小体。ANA-IIF阳性者与靶抗原阳性者并非一一对应,与方法学存在检测范围、灵敏度与特异性差异有关。ANCA特异性靶抗原:在BA组中以MPO和PR3为靶抗原者有分别占12.5%和12.0%,其中有13例(6.5%)BA患儿MPO和PR3靶抗原同时阳性,任一阳性(MPO or/and PR3)占18.3%。而在DC组,以MPO和PR3为靶抗原者分别占6.5%和14.2%,任一阳性占14.2%,在NC组有2例MPO靶抗原为阳性,占4.2%。任一靶抗原(MPO or/and PR3)在BA组与正常对照组的阳性率差异有统计学意义(P<0.05),但BA组与疾病对照组的阳性率无统计学差异(P>0.05)。疾病对照组和正常对照组间尚未发现有统计学差异(P>0.05)。抗M2-3E抗体验证:通过扩大样本量,对检出率差异蛋白的验证,前后结果几乎一致。抗M2-3E抗体在BA术前或术后的检出率均明显高于疾病对照组和正常对照组,差异有统计学意义(术前25.8%&术后28.6%&8.6%&4.2%,P<0.05)。
3.差异性自身抗体与人巨细胞病毒:本研究中80例BA患儿在确诊前进行了人巨细胞病毒检测,其中36例(45%)存在人巨细胞病毒感染。ANCA相关抗体(ANCA-IIF/anti-MPO/anti-PR3)阳性者感染人巨细胞病毒率大于抗体阴性者,但感染率差异为统计学意义(P>0.05)。同样地,抗M2-3E抗体阳性者与阴性者的人巨细胞病毒感染率都差异也无统计学意义(51.9%&41.5%,P>0.05)。差异性自身抗体与BA肝纤维化程度:ANCA相关抗体在BA的F0-4级分别占50.0%,30.0%,41.7%,32.0%和44.4%,不同级别变化不明显;抗M2-3E抗体在F0-4级检出率分别占25.0%,27.0%,16.7%,32.0%和22.2%,不同级别的抗体阳性率波动也不明显。差异性抗体与BA肝纤维严重程度尚未发现相关性,无论肝纤维化程度严重与否,自身抗体都存在。差异抗体在不同年龄段分布:ANCA相关抗体/anti-M2-3E在BA组12个月龄前的阳性率保持在同一水平,到≥12月后才有相对下降的趋势。可见抗体在BA患儿血清中长期存在。随访病例分析:发现ANCA/anti-MPO/anti-PR3抗体与术后胆管炎发生存在关联性(P<0.05)。抗体持续阳性者,胆管炎发生率增高,抗体一直阴性者,术后发生胆管炎发生率低,抗体水平下降/转阴者,发生胆管炎率也下降。关于术后黄疸消退与ANCA/anti-MPO/anti-PR3的关系,未发现明显相关。抗M2-3E抗体在术后胆管炎发生和黄疸消退预测值也未见统计学意义(P>0.05)。
结论:
1.自身免疫现象在BA中普遍存在。尽管这些常见自身抗体缺乏BA疾病特异性,不能作为BA诊断以及鉴别诊断的指标,但高检出率的自身抗体提供了最为直接的证据,支持自身免疫参与BA致病机制。
2.ANCA相关抗体与BA术后胆管炎出现存在关联。
3.抗M2-3E抗体主要出现于成人,本研究首次发现抗M2-3E抗体在部分BA患儿血清中出现,其来源和预后判断价值仍待进一步研究。
4.抗体在BA患儿血清中长期存在,也许与BA免疫系统紊乱激活的病理病态有关。