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骨髓间充质干细胞(BM-MSCs)在一定条件下可以定向分化成为某种成体干细胞、成体细胞或者横向分化为多种组织细胞的潜力,因而备受人们关注。BM-MSCs在肝脏损伤的修复中起到非常重要的作用,它可能是肝脏干细胞的来源之一,有望成为治疗终末期肝病的一种新型种子细胞。对BM-MSCs分化为肝细胞进行深入的研究,有望给肝病患者带来新的希望。
目的:
建立BM-MSCs体外分离培养纯化的方法,观察BM-MSCs的形态、生长特性及表面抗原,研究其体外培养的生物特性。探讨肝细胞生长因子(HGF)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)诱导BM-MSCs分化为肝样细胞的可行性,为进一步深入研究和临床应用提供基础。
方法:
1BM-MSCs的分离培养:取4周龄SD大鼠,雌雄不限,无菌条件下提取原代BM-MSCs,体外通过全骨髓差异贴壁法培养、纯化、扩增,倒置相差显微镜观察细胞生长情况。
2 BM-MSCs的鉴定:将获得的第三代P3BM-MSCs采用流式细胞术进行细胞表面抗原鉴定及成骨诱导分化进行鉴定。
3 BM-MSCs体外诱导分化为肝样细胞及相关标志物检测:(1)实验分组:①M0组:不添加任何因子,设为阴性对照;②M1组:20ng/m1HGF,阳性对照组;③M2组:20ng/ml HGF+5ng/ml bFGF:④M3组:20ng/ml HGF+10ng/ml bFGF;⑤M4组:20ng/ml HGF+20ng/mlbFGF;(2)诱导分化:取P3BM-MSCs细胞,待其90％融合后,胰酶消化,调整细胞密度为2×104/ml,按实验分组接种于6孔板中,每隔3天换液一次;(3)肝样细胞鉴定:诱导后7d、14d、21d留取细胞,提取RNA,RT-PCR半定量检测AFPmRNA和ALBmRNA的表达水平,免疫细胞化学检测AFP、ALB表达情况。
结果:
1全骨髓差异贴壁法获得的细胞接种6d后见原代BM-MSCs呈集落样生长,集落逐渐增大,第8～12d集落相互接触,并铺满整个培养瓶底部,呈辐射状或漩涡状排列,至第2代台盼蓝染色细胞活力可达98%左右。
2流式细胞仪检测BM-MSCs CD29阳性表达细胞比率为99.81%,CD34阳性细胞比率为0.28%,CD45阳性细胞比率为0.29%,CD90阳性细胞比率为96.03%。成骨诱导3周后,BM-MSCs可分化为成骨细胞,形成明显的圆形或卵圆形钙化结节,Von-Kossa法测矿化结节染色阳性,同期未诱导培养组细胞内未见矿化结节。
3肝细胞特征性标志物检测:M1～M4组诱导第7d、14d、21d的细胞。RT-PCR检测:AFPmRNA在诱导培养第7d开始表达,14d表达降低,21d表达为阴性。ALBmRNA第14d始出现表达,而后持续,21d表达增强。免疫细胞化学染色结果:AFP在诱导第7d细胞基本为阳性着色,在诱导第14d时表达降低,21d表达为阴性。ALB作为成熟肝细胞的表型标志第14d细胞开始出现表达,而后持续。M0对照组未见阳性染色,同一时间点,M1-4组间细胞阳性染色率差异有统计学意义(P＜0.05),其中M1与M2,M3与M4.比较,差异均无统计学意义(P＞0.05),细胞阳性染色率差异不明显,M3、M4与M2比较,差异有统计学意义(P＜0.05),M3、M4组细胞阳性染色率较高。
结论:
1采用全骨髓差异贴壁法分离培养的BM-MSCs增殖力强,而且具有较高的活力和纯度。
2 HGF和bFGF体外可以诱导BM-MSCs定向分化为表达AFP、ALB的肝样细胞,而且二者有协同作用。
3联合应用HGF和bFGF诱导BM-MSCs分化为肝样细胞,其中bFGF的适宜浓度为10ng/ml,bFGF浓度提高到20ng/ml并不能提高BM-MSCs分化为肝样细胞,低浓度的bFGF(5ng/ml)也不能发挥其联合诱导中的协同作用。