基于组学的动物药快速鉴定及活性肽筛选研究

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我国动物药种类繁多、药用历史悠久,是中医药体系中不可分割的重要组成部分。其中,名贵动物药占比大,市场上使用相应伪品、劣品以及代用品冒充正品的现象层出不穷,常用动物药鉴别方法具有明显局限性。生物活性蛋白肽类是动物药的主要药效物质基础,该类物质成分复杂、研究难度大。这些原因使得动物药资源开发困难,因此,有必要开发适用性广、实用高效的动物药品种鉴定以及活性成分研究方法。据此,本论文主要研究内容分为以下两部分:(1)结合全基因组单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)标记技术,建立基于多重连接依赖探针扩增(multiplex ligation-dependent probe amplification,MLPA)技术的实时荧光PCR(quantitative real-time PCR,RT-PCR)分析方法实现物种快速鉴别。以乌龟、花龟与花杂草龟的分子鉴定为研究案例,构建乌龟首个基因型测序(genotyping by sequencing,GBS)基因组文库以及花龟重测序基因组文库。所得花龟文库为55.6 Gb,GBS文库仅1.1 Gb。文库序列经多态性比对生成高质量SNP标记88,087个。随机选取20个SNP位点采用扩增测序分析方法对18批龟甲样品进行基因型分析。结果显示SNP位点88、105、178以及223能够有效区分三种龟品种。为使鉴别方法更加高效,以SNP标记88为例设计MLPA反应的物种特异性探针。DNA样品在MLPA连接反应后进行RT-PCR扩增,并自动采集扩增信号。乌龟、花龟、花杂草龟样品分别在81.01±0.03℃、79.48±0.01℃以及80.99±0.03℃和79.33±0.01℃处出现溶解曲线峰。该鉴别法可以快速(<3 h)、直观地用于三种龟的鉴别。(2)基于磁固相萃取和蛋白质组学技术,以日本医蛭(Hirudo nipponica)和菲牛蛭(Maneensis Poecilobdella)抗凝活性肽成分研究为代表,开发了一种操作简单、适用性广的动物药生物活性肽筛选鉴定方法。采用通用合成方法制备凝血酶固定化磁纳米粒。经红外以及透射电镜表征,凝血酶成功固定于磁珠上,并且酶活稳定性良好(37℃,19 d,RSD<4.74%)。将日本医蛭、菲牛蛭粗提液分别进行磁固相萃取,收集洗脱液并采用Triple TOF LC-MS/MS分析技术完成质谱验证。对于相关研究报道较少的日本医蛭,构建其唾液腺转录组质谱库用于MS/MS扫描比对。经验证日本医蛭洗脱液中含有五种水蛭素变体以及失稳酶类的潜在抗凝血酶成分。菲牛蛭蛋白质谱库根据已报道的菲牛蛭蛋白序列从NCBI数据库中下载生成。最终,在菲牛蛭洗脱液样本中成功鉴定出一种水蛭素变体序列。
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