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纤维化是肝、肾、肺及皮肤等多种器官组织慢性炎症病变的结果。在炎症 刺激下，原先处于静息状态或前体状态的细胞外间质（ECM）产生细胞（成纤维 细胞、HSC／MFLC等）被激活并增殖，这些处于激活状态的细胞产生过量以胶原 为主的ECM导致纤维化的发生和发展。目前的研究资料指出，在纤维化的病理 过程中有多种细胞因子参与。其中 PDGF、IGF、Insulin、TNFα等刺激 ECM产生 细胞增殖。TGF-β、IGF、Insulin等刺激以胶原蛋白为主的ECM合成，而TNF α、IFN α、IFN γ等则抑制ECM产生细胞分泌胶原蛋白。但这其中的机制以及 这些细胞因子之间存在的复杂的相互关系均不是很清楚。 Ⅰ型胶原是纤维化时产生的主要的胶原蛋白，其基因的表达与调控是长期以 来备受关注的问题。Ⅰ型胶原α1链（COL1A1）与 α2链（COL1A2）启动子克隆 成功以来，细胞因子对Ⅰ型胶原启动子活性调控的研究取得了一定的进展，但 对细胞因子在转录水平的相互关系报道甚少，与治疗纤维化有关的药物对这些 启动子的作用也鲜见报道。 基于以上原因，本文进行了以下工作：（1）构建人COL1A1启动子pCOLH质 粒重组体，测定各重组体的活性，探讨其调控序列所存在的部位。（2）观察PDGF -BB、IGF-1以及中药制剂苦参碱与氧化苦参碱对ECM产生细胞增值的影响， 并探讨其机理。（3）调查细胞因子和苦参碱等药物对人COL1A1启动子活性的调 控。 中文摘要 第一部分PCOLH质粒重组体的构建及活性测定 以含人COLIAI基因6．3kb～巧 的质粒为模板，PCR扩增得到六个具有 相同3’端的长短分别为0．Ikb、0．27kb、0．skb、0．gkb、1．skb、2．skb的片段 分别作为启动子，与不含启动子但含报告基因的载体pCAT3－Enhancer分别组成 重组体PCOLHO．l、PCOLHO．27、PCOLHO 5、PCOLHO．9、PCOLHI．5、PCOLHZ．5。这 些重组体经酶切鉴定正确，分别相应于人COLIAI基因上游l05～巧2b卜七68～ －42hp、－496～＋42hp、－829～－42hp、－1448～＋42hp、－2犯3～＋42hp的序列。经 测序，插入片段与 GENEBANK（accession X98705）报道的序列完全一致。用 Fugene 转染法将各重组体瞬时转染至正常人皮肤成纤维细胞，用ELISA法测定细胞报 告基因CAT表达量。以PCOLHZ．5转染细胞后CAT表达量为1，计算出其余重组 体转染细胞后的“T相对表达量。结果表明转染PCOLHO．27、PCOLHZ．5重组体 的细胞具有高CAT表达量。按活性的强弱排列为PCOLHZ．5、PCOLHO．27、 PCOLHI．5、PCOLHO．9、PCOLHO．5、PCOLHO．1，它们 的CAT表达依次为：1．0、0．97 HO．04、0．73H0．11、0．36H0．09、0．20H0．05与 0．10H0．02。 该结果提示在人COLIAI基因上游5’侧翼区－2．skb序列中存在正性和负性调 控元件。正性调控元件可能存在子－2483～1448hP、－1448～829hP、－829～ 496hP、－268一105hP，而负性调控元件则可能存在于－496～268hP。采用计算 机DNAssist．0软件模拟分析《484～叶 可能存在的核蛋白因子，提示在－ 101hP有NF—1识别位点、－103hP有AP－1结合位点、－123hP有SP－1结合位点， 这些转录因子识别位点可能与七68～叫 的高启动活性有关。在七483～叫 这2．skb的序列中有5个SP－1（－123，－1615，－1628，－2170，－2176）、l个NF。B（－ 1571）、2个c－mvc（lll－2406）、2个AP－1（－103，－1985）核蛋白结合位点，其 中，Sp－1、Ap－l、c－myc可能与该段序列的高启动活性有关。本研究结果与Jimenez 等的报告相似，但调控序列的定位则不完全相同，这可能与不同研究中所用的 研究手段及构建的重组体所含启动子片段不完全相同有关。 本研究除了对胶原基因上游序列进行启动活性分析、了解人COLIAI基因 转录调控序列外，其意义还在于为研究相应核转录因子提供可能。另外，应用 本研究中构建的6个重组体，还能对致／抗纤维化相关因子的作用机制进行转录 水平的探讨，进一步研究相应于这些高启动活性序列的DNA结合蛋白，在激活 态胶原产生细胞中发现纤?