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研究背景:
肺泡巨噬细胞是免疫的主要效应细胞之一，有效地识别并结合清除病原体，同时释放多种生物活性物质参与免疫防御反应。PM2.5指的是直径小于2.5微米的物质，包括无机成分、有机成分、微量金属元素、元素碳、生物物质(细菌、病菌、霉菌等)等。颗粒直径大于2.5微米的物质对人体危害相对较小；而颗粒直径在2.5微米以下的颗粒物，可以引起人类多种疾病。空气中二氧化硅(SiO2)主要由扬尘所致，二氧化硅被吸进入人体后，免疫系统最先启动的是天然免疫，而巨噬细胞发挥着重要的作用。巨噬细胞对二氧化硅的吞噬、自噬、以及凋亡中一系列的免疫分子的变化，尤其是凋亡变化中相关时间点的浓度变化目前尚未阐明清楚。褪黑激素(Melatonin)，是由哺乳动物以及人类的松果体产生的一种胺类激素。Melatonin在巨噬细胞对二氧化硅吞噬过程中是否有调节作用，尤其是巨噬细胞凋亡变化中能否有调节作用目前尚未阐明清楚。
研究目的:
1.明确SiO2刺激的RAW264.7细胞的自噬、凋亡炎症反应的分子机制。
2.阐明褪黑素(Melatonin)对纳米SiO2刺激的RAW264.7细胞自噬、凋亡通路及炎症的影响。
研究方法:
1.MTT检测纳米二氧化硅对RAW264.7细胞存活率的影响
通过ELISA检测MTT结晶形成的量，得到二氧化硅对RAW264.7细胞存活率是否受到影响。
2.LDH检测纳米二氧化硅对RAW264.7细胞不同时间节点的活性
通过ELISA检测培养上清液中的LDH含量，得到二氧化硅对RAW264.7细胞时，RAW264.7细胞释放LDH酶的活性值。
3.RAW264.7细胞的培养、纳米级二氧化硅及褪黑素的处理与干预
处理组：用100μg/ml的混悬于DMEM培养液的10nmSiO2在0、2、4、8、12、24小时分别刺激RAW264.7，收集各个时间点的上清液和细胞蛋白成分，进行后续实验。
干预组：做以下四组，每组三孔，每孔1mlDMEM培养液，0h组不加10-20纳米SiO2悬液和Melatonin，DMSO组只加1μl的DMSO，SiO2组加10-20纳米SiO2悬液使得孔的终浓度达到100μg/ml，SiO2+Melatonin组加入10-20纳米SiO2悬液使得孔的终浓度达到100μg/ml，同时加入1μl的200mmol/mlMelatonin，使其终浓度达到200μmol/ml。后三组作用12h后，收集0h组，DMSO组，SiO2组和SiO2+Melatonin组的培养的细胞上清液和细胞蛋白成分，进行后续实验。
4.ELISA检测细胞培养上清炎症因子TNF-α、IL-1β和IL-18的水平
用ELISA试剂盒检测0h、2h、4h、8h、12h、24h各点的TNF-α以及0h组，DMSO组，SiO2组和SiO2+Melatonin组中的TNF-α、IL-1β和IL-18值，以标准品的OD值为参考计算出收集的上清液中各点的TNF-α、IL-1β和IL-18的水平。
5.WesternBlot检测自噬和凋亡信号通路蛋白表达
采用WesternBlot方法检测0、2、4、8、12、24小时各点的beclin1，LC3、bax、bcl-2、bax/bcl-2及caspase-3的变化趋势；另外检测0h组，DMSO组，SiO2组和SiO2+Melatonin组的beclin1，LC3、bax、bcl-2、bax/bcl-2及caspase-3的变化趋势。
6.激光共聚焦显微镜观察GFP-LC3转染的RAW264.7细胞自噬颗粒的改变
含GFP-LC3质粒的RAW264.7细胞种植于处理的薄片上面，按处理组和干预组的处理步骤后。将薄片封片，放于激光共聚焦显微镜上进行成像。
7.透视电镜观察自噬体数目
通过制备0h组，DMSO组，SiO2组和SiO2+Melatonin组的电镜玻片，在JEM-1230型透射电镜下扫描RAW264.7细胞中的吞噬小体和吞噬泡。
8.流式细胞仪检测RAW264.7细胞凋亡率
在488nm波长下通过AnnexinV-EGFP的绿色荧光FITC通道(FL1)和PI红色荧光通道PE-Cy5(FL4)检测处理组和干预组的各个小组的细胞的凋亡率，通过Q2+Q3，得到处理组和干预组的凋亡情况。
9.统计学方法
统计使用SPSS20.0软件；数据用均数±标准误表示；采用单因素的方差分析，P＜0.05表示差异有显著性。
研究结果:
1.MTT对纳米二氧化硅刺激的RAW264.7细胞存活率没影响
通过实验我们发现，与对照组(0μg/ml二氧化硅)相比，100μg/ml纳米二氧化硅在不同时间点对RAW264.7细胞存活率基本没有影响。[F(6，36)=1.608，P=0.188，figure=1.608]。
2.LDH检测纳米二氧化硅诱导RAW264.7细胞不同时间节点的活性不断增强
ELISA检测显示LDH随纳米二氧化硅诱导刺激RAW264.7细胞0h、2h、4h、8h、12h、24h，其值不断升高，且有明显的统计学意义。
3.SiO2刺激的RAW264.7培养上清液中TNF-α随时间逐渐升高，而Melatonin减低上清液中TNF-α和升高上清液IL-1β和IL-18的水平
当100μg/ml纳米SiO2刺激RAW264.7后，2h、4h、8h、12h、24h每个时间点TNF-α随时间逐渐升高，与0h对照相比均有显著性的统计学意义。SiO2+Melatonin组与SiO2组相比较，TNF-α下降明显，具有显著的统计学意义。SiO2+Melatonin组与SiO2组相比较，前者的IL-1β和IL-18含量均明显增高，且有显著性的统计学意义。DMSO组，SiO2组和SiO2+Melatonin组与0h对照组相比均有显著性的统计学意义。
4.SiO2刺激的RAW264.7随时间自噬和凋亡信号增强，Melatonin促进自噬，降低凋亡
100μg/ml的SiO2在0h、2h、4h、8h、12h、24h刺激后，beclin1、bax、bax/bcl、caspase-3、LC3均随时间点呈递增的趋势，bcl-2随时间点呈递减趋势。LC3变化最明显，在12h和24h较0h有显著的统计学差异。Bax和caspase-3在24h时间点与0h相比也有显著的统计学差异。beclin1的2h、4h、8h、12h、24h各点与0h比较虽有增高，但没有统计学显著差异。bcl-2随时间点减低，24h最低，也没有统计学显著差异。检测的0h组，DMSO组，SiO2组和SiO2+Melatonin组中，beclin1、LC3均随时间点呈递增的趋势，SiO2+Melatonin组与SiO2组比较，LC3明显增高，且有显著的统计学差异。SiO2+Melatonin组与SiO2组比较，Bax明显减低，且有显著的统计学差异。SiO2+Melatonin组与SiO2组比较，bcl-2和caspase-3减低，但是没有显著的统计学差异。
5.激光共聚焦显微镜成像显示自噬的GFP-LC3点状颗粒明显增多，Melatonin增加GFP-LC3点状颗粒
12h和24h的RAW264.7细胞质中的GFP-LC3点状颗粒明显增多。SiO2+Melatonin比SiO2组RAW264.7细胞质中的GFP-LC3点状颗粒明显增多。
6.流式细胞仪检测显示SiO2刺激的RAW264.7随时间凋亡率不断增加，Melatonin能降低SiO2刺激引起的凋亡率
用100μg/ml的混悬于DMEM培养液的10nmSiO2在0、2、4、8、12、24小时分别刺激RAW264.7，随时间的增加凋亡率不断增加，具有显著性的统计意义。SiO2+Melatonin组比SiO2组凋亡率降低，SiO2+Melatonin组与SiO2组比较具有显著性的统计意义。
7.透视电镜扫描显示Melatonin促进纳米二氧化硅刺激的RAW264.7的吞噬小体数目的增加
SiO2组和SiO2+Melatonin组形成明显的吞噬小泡，里面含有数量不等的吞噬小体。SiO2+Melatonin组比SiO2组吞噬小体数多，SiO2+Melatonin组与SiO2组比较具有显著性的统计意义。SiO2+Melatonin组与SiO2组均比0h组和DMSO组吞噬小体数明显增多，且具有显著性的统计意义。
研究结论：
1.SiO2刺激的RAW264.7后，导致RAW264.7自噬、凋亡与炎症水平不断增加。
2.Melatonin有促进纳米SiO2刺激的RAW264.7细胞自噬、及减弱细胞凋亡的作用。
3.Melatonin对纳米二氧化硅刺激的RAW264.7炎症方面，细胞因子TNF-α的含量降低，IL-1β和IL-18的含量升高。
肺泡巨噬细胞是免疫的主要效应细胞之一，有效地识别并结合清除病原体，同时释放多种生物活性物质参与免疫防御反应。PM2.5指的是直径小于2.5微米的物质，包括无机成分、有机成分、微量金属元素、元素碳、生物物质(细菌、病菌、霉菌等)等。颗粒直径大于2.5微米的物质对人体危害相对较小；而颗粒直径在2.5微米以下的颗粒物，可以引起人类多种疾病。空气中二氧化硅(SiO2)主要由扬尘所致，二氧化硅被吸进入人体后，免疫系统最先启动的是天然免疫，而巨噬细胞发挥着重要的作用。巨噬细胞对二氧化硅的吞噬、自噬、以及凋亡中一系列的免疫分子的变化，尤其是凋亡变化中相关时间点的浓度变化目前尚未阐明清楚。褪黑激素(Melatonin)，是由哺乳动物以及人类的松果体产生的一种胺类激素。Melatonin在巨噬细胞对二氧化硅吞噬过程中是否有调节作用，尤其是巨噬细胞凋亡变化中能否有调节作用目前尚未阐明清楚。
研究目的:
1.明确SiO2刺激的RAW264.7细胞的自噬、凋亡炎症反应的分子机制。
2.阐明褪黑素(Melatonin)对纳米SiO2刺激的RAW264.7细胞自噬、凋亡通路及炎症的影响。
研究方法:
1.MTT检测纳米二氧化硅对RAW264.7细胞存活率的影响
通过ELISA检测MTT结晶形成的量，得到二氧化硅对RAW264.7细胞存活率是否受到影响。
2.LDH检测纳米二氧化硅对RAW264.7细胞不同时间节点的活性
通过ELISA检测培养上清液中的LDH含量，得到二氧化硅对RAW264.7细胞时，RAW264.7细胞释放LDH酶的活性值。
3.RAW264.7细胞的培养、纳米级二氧化硅及褪黑素的处理与干预
处理组：用100μg/ml的混悬于DMEM培养液的10nmSiO2在0、2、4、8、12、24小时分别刺激RAW264.7，收集各个时间点的上清液和细胞蛋白成分，进行后续实验。
干预组：做以下四组，每组三孔，每孔1mlDMEM培养液，0h组不加10-20纳米SiO2悬液和Melatonin，DMSO组只加1μl的DMSO，SiO2组加10-20纳米SiO2悬液使得孔的终浓度达到100μg/ml，SiO2+Melatonin组加入10-20纳米SiO2悬液使得孔的终浓度达到100μg/ml，同时加入1μl的200mmol/mlMelatonin，使其终浓度达到200μmol/ml。后三组作用12h后，收集0h组，DMSO组，SiO2组和SiO2+Melatonin组的培养的细胞上清液和细胞蛋白成分，进行后续实验。
4.ELISA检测细胞培养上清炎症因子TNF-α、IL-1β和IL-18的水平
用ELISA试剂盒检测0h、2h、4h、8h、12h、24h各点的TNF-α以及0h组，DMSO组，SiO2组和SiO2+Melatonin组中的TNF-α、IL-1β和IL-18值，以标准品的OD值为参考计算出收集的上清液中各点的TNF-α、IL-1β和IL-18的水平。
5.WesternBlot检测自噬和凋亡信号通路蛋白表达
采用WesternBlot方法检测0、2、4、8、12、24小时各点的beclin1，LC3、bax、bcl-2、bax/bcl-2及caspase-3的变化趋势；另外检测0h组，DMSO组，SiO2组和SiO2+Melatonin组的beclin1，LC3、bax、bcl-2、bax/bcl-2及caspase-3的变化趋势。
6.激光共聚焦显微镜观察GFP-LC3转染的RAW264.7细胞自噬颗粒的改变
含GFP-LC3质粒的RAW264.7细胞种植于处理的薄片上面，按处理组和干预组的处理步骤后。将薄片封片，放于激光共聚焦显微镜上进行成像。
7.透视电镜观察自噬体数目
通过制备0h组，DMSO组，SiO2组和SiO2+Melatonin组的电镜玻片，在JEM-1230型透射电镜下扫描RAW264.7细胞中的吞噬小体和吞噬泡。
8.流式细胞仪检测RAW264.7细胞凋亡率
在488nm波长下通过AnnexinV-EGFP的绿色荧光FITC通道(FL1)和PI红色荧光通道PE-Cy5(FL4)检测处理组和干预组的各个小组的细胞的凋亡率，通过Q2+Q3，得到处理组和干预组的凋亡情况。
9.统计学方法
统计使用SPSS20.0软件；数据用均数±标准误表示；采用单因素的方差分析，P＜0.05表示差异有显著性。
研究结果:
1.MTT对纳米二氧化硅刺激的RAW264.7细胞存活率没影响
通过实验我们发现，与对照组(0μg/ml二氧化硅)相比，100μg/ml纳米二氧化硅在不同时间点对RAW264.7细胞存活率基本没有影响。[F(6，36)=1.608，P=0.188，figure=1.608]。
2.LDH检测纳米二氧化硅诱导RAW264.7细胞不同时间节点的活性不断增强
ELISA检测显示LDH随纳米二氧化硅诱导刺激RAW264.7细胞0h、2h、4h、8h、12h、24h，其值不断升高，且有明显的统计学意义。
3.SiO2刺激的RAW264.7培养上清液中TNF-α随时间逐渐升高，而Melatonin减低上清液中TNF-α和升高上清液IL-1β和IL-18的水平
当100μg/ml纳米SiO2刺激RAW264.7后，2h、4h、8h、12h、24h每个时间点TNF-α随时间逐渐升高，与0h对照相比均有显著性的统计学意义。SiO2+Melatonin组与SiO2组相比较，TNF-α下降明显，具有显著的统计学意义。SiO2+Melatonin组与SiO2组相比较，前者的IL-1β和IL-18含量均明显增高，且有显著性的统计学意义。DMSO组，SiO2组和SiO2+Melatonin组与0h对照组相比均有显著性的统计学意义。
4.SiO2刺激的RAW264.7随时间自噬和凋亡信号增强，Melatonin促进自噬，降低凋亡
100μg/ml的SiO2在0h、2h、4h、8h、12h、24h刺激后，beclin1、bax、bax/bcl、caspase-3、LC3均随时间点呈递增的趋势，bcl-2随时间点呈递减趋势。LC3变化最明显，在12h和24h较0h有显著的统计学差异。Bax和caspase-3在24h时间点与0h相比也有显著的统计学差异。beclin1的2h、4h、8h、12h、24h各点与0h比较虽有增高，但没有统计学显著差异。bcl-2随时间点减低，24h最低，也没有统计学显著差异。检测的0h组，DMSO组，SiO2组和SiO2+Melatonin组中，beclin1、LC3均随时间点呈递增的趋势，SiO2+Melatonin组与SiO2组比较，LC3明显增高，且有显著的统计学差异。SiO2+Melatonin组与SiO2组比较，Bax明显减低，且有显著的统计学差异。SiO2+Melatonin组与SiO2组比较，bcl-2和caspase-3减低，但是没有显著的统计学差异。
5.激光共聚焦显微镜成像显示自噬的GFP-LC3点状颗粒明显增多，Melatonin增加GFP-LC3点状颗粒
12h和24h的RAW264.7细胞质中的GFP-LC3点状颗粒明显增多。SiO2+Melatonin比SiO2组RAW264.7细胞质中的GFP-LC3点状颗粒明显增多。
6.流式细胞仪检测显示SiO2刺激的RAW264.7随时间凋亡率不断增加，Melatonin能降低SiO2刺激引起的凋亡率
用100μg/ml的混悬于DMEM培养液的10nmSiO2在0、2、4、8、12、24小时分别刺激RAW264.7，随时间的增加凋亡率不断增加，具有显著性的统计意义。SiO2+Melatonin组比SiO2组凋亡率降低，SiO2+Melatonin组与SiO2组比较具有显著性的统计意义。
7.透视电镜扫描显示Melatonin促进纳米二氧化硅刺激的RAW264.7的吞噬小体数目的增加
SiO2组和SiO2+Melatonin组形成明显的吞噬小泡，里面含有数量不等的吞噬小体。SiO2+Melatonin组比SiO2组吞噬小体数多，SiO2+Melatonin组与SiO2组比较具有显著性的统计意义。SiO2+Melatonin组与SiO2组均比0h组和DMSO组吞噬小体数明显增多，且具有显著性的统计意义。
研究结论：
1.SiO2刺激的RAW264.7后，导致RAW264.7自噬、凋亡与炎症水平不断增加。
2.Melatonin有促进纳米SiO2刺激的RAW264.7细胞自噬、及减弱细胞凋亡的作用。
3.Melatonin对纳米二氧化硅刺激的RAW264.7炎症方面，细胞因子TNF-α的含量降低，IL-1β和IL-18的含量升高。