【摘 要】
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农药是重要的农业生产资料,但其不科学不合理的使用导致害虫抗性进化迅速,对害虫的抗性治理成为农业生产中的难点。利用RNAi技术沉默昆虫解毒酶系相关基因可降低其对杀虫剂的代谢抗性,利用纳米载体共同递送用于抗性基因RNAi的dsRNA和农药分子可作为抗性治理的潜在工具。介孔有机二氧化硅（Mesoporous organosilica nanoparticls,MON）是一类具有高比表面积、易进行修饰的纳
【基金项目】
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国家自然科学基金“纳米载体高效递送dsRNA系统的构建及毒理学效应研究（31972302）”；
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农药是重要的农业生产资料,但其不科学不合理的使用导致害虫抗性进化迅速,对害虫的抗性治理成为农业生产中的难点。利用RNAi技术沉默昆虫解毒酶系相关基因可降低其对杀虫剂的代谢抗性,利用纳米载体共同递送用于抗性基因RNAi的dsRNA和农药分子可作为抗性治理的潜在工具。介孔有机二氧化硅（Mesoporous organosilica nanoparticls,MON）是一类具有高比表面积、易进行修饰的纳米材料,构建基于MON的共递送系统可同时携带dsRNA和农药分子进入昆虫体内,递送dsRNA沉默抗性相关基因及释放出农药分子,实现对害虫的抗性治理,本研究主要结果如下:（1）利用分子生物学技术,基于L4440质粒和大肠杆菌HT115（DE3）菌株,构建高效诱导表达二化螟抗性相关P450家族基因CsCYP321F3和UGT家族基因CsUGT40AL1的合成方法,诱导表达产生的dsRNA条带清晰,大小正确。（2）以十六烷基三甲基溴化铵和水杨酸钠为模板,原硅酸四乙酯和双-[3-（三乙氧基硅基）丙基]-四硫化物为硅源,采用水热法合成粒径约为80 nm的有机二氧化硅纳米粒子,经硅烷偶联剂3-（乙氧基硅基）丙基琥珀酸酐完成羧基化修饰后负载氯虫苯甲酰胺,在EDS和NHS催化下利用酰胺反应将阳离子聚合物聚乙烯亚胺接枝至MON表面,最终在静电作用下完成dsRNA的负载,成功构建共递送纳米载体dsRNA/Chl@MON-PEI。通过多项表征技术对该共递送纳米载体进行分析,结果表明:dsRNA/Chl@MON-PEI纳米载体成功制备,粒径均一,氯虫苯甲酰胺负载率为14.40%,dsRNA负载量约10.00%。（3）进一步对该共递送纳米载体dsRNA/Chl@MON-PEI进行分析,稳定性实验表明MON-PEI可显著提高dsRNA的稳定性,保护dsRNA免受RNAase降解,延长dsRNA储存时间。细胞实验表明MON可有效降低PEI的细胞毒性;MON-PEI可有效提高细胞对dsRNA的摄取,相较于单独dsRNA处理,dsRNA@MON-PEI处理后细胞靶基因表达量显著下调约31.92%。室内生物活性测定结果表明该共递送纳米载体可有效克服二化螟对氯虫苯甲酰胺的抗性,增强氯虫苯甲酰胺对二化螟的毒力;相较于Chl@MON-PEI,ds CsCYP321F3/Chl@MON-PEI和CsUGT40AL1/Chl@MON-PEI对二化螟的LC50从48.64 mg/L显著下降至32.37 mg/L和30.14 mg/L;利用qRT-PCR测定dsRNA、dsRNA@MON-PEI处理后二化螟体内目的基因的表达量变化,结果表明纳米载体的使用可有效递送dsRNA进入试虫体内发挥RNAi作用沉默靶标基因。
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