棘白菌素B及其母核的分离纯化工艺研究

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真菌感染疾病,尤其是深部真菌感染疾病的发病率和致死率逐年增加,因此抗真菌药物的研发将会成为人类面临的一个难题。棘白菌素类药物是20世纪70年代发现的一组天然产物,由相似的环状多肽核心和不同的脂肪酸侧链组成,通过非竞争性作用抑制细胞壁中0-(l,3)-D-葡聚糖的合成,而发挥其抗真菌作用。具有作用机制独特,不良反应率低,且对一些唑类和两性霉素B耐药的真菌具有很强的抗菌活性等特点。目前己经上市的棘白菌素类药物有三种,分别是卡泊芬净(caspofungin)、米卡芬净(micafungin)和阿尼芬净(anidulafimgin)?其中阿尼芬净作为第三代棘白菌素类的半合成抗真菌药,2006年12月在美国首次上市,与其他棘白菌素类抗真菌药相比,阿尼芬净具有更大的分布容积和更广谱的抗菌活性。阿尼芬净是由棘白菌素B(Echinocandin B,ECB)通过微生物转化切除脂肪酸侧链,得到棘白菌素B母核(Echinocandin B Nucleus, ECBN)后,再通过化学合成的方法加上新的侧链而制得。ECB和ECBN作为制备阿尼芬净的两个最重要的中间产物,其分离纯化工艺一直是制备该药物的关键。通过对ECB的初提、色素的去除、纯化、精制方面的研宄,确立了一条完整可行的ECB分离纯化工艺。先向ECB菌丝体中加入2倍菌丝体体积的60%乙醇溶液,pH调至4.0,超声浸提3小时后将浸提液过滤,重复上述步骤浸提第二次;再通过阳离子交换树脂FPCl INa对ECB浸提液中的色素进行去除,确立最佳上柱pH为5,上柱流速为5mL/min;然后利用大孔吸附树脂SP825进行纯化,上柱液pH调至5,以4mL/min的流速上柱,2倍柱体积20%乙醇水溶液除强极性杂质和部分色素,70%乙醇水溶液解吸;最后用NM100树脂精制,以pH5.0,流速3mL/min上柱,30%乙醇水溶液除强杂和色素,80%乙醇解吸,最终ECB的HPLC纯度在93%,得到产物的收率为50%。同时对ECBN的分离纯化工艺进行了研究,先确定ECBN在pH4.5下最稳定;再用大孔吸附树脂XAD-18对ECBN进行第一次柱分离,上柱pH为4.5,流速为3mL/min,2倍柱体积的pH4.5水除强极性杂质和盐,17%甲醇水溶液(pH4.5)进行解吸:最后用亲水性C18填料进行精制,自然流速上柱,pH4.5水除极性杂质和盐,直到ECBN有少量泄漏后改用3%甲醇水溶液(pH4.5)解吸,最终ECBN的纯度为97%,得到产物的收率为65%。最后,利用LC-MS对分离后的ECBN进行了质量分析。
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