背景种子细胞的选择是进行细胞组织工程研究的基础。胚胎干细胞作为一种全能干细胞,是最理想的种子细胞,但是在获取胚胎干细胞的过程中需要破坏囊胚,存在伦理学争议,并且将胚胎干细胞移植入个体后会引起免疫排斥并导致畸胎瘤,因而限制了它在科研和临床中的应用。随着研究的深入,学者发现间充质干细胞不存在以上问题,逐渐成为细胞组织工程研究的热点。首先,间充质干细胞是一种起源于中胚层间质的成体干细胞,具有自我更新和多向分化潜能,在适宜的体内或体外环境下可以向多种细胞分化,特别是中胚层和神经外胚层来源的组织细胞,如成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、心肌细胞、血管内皮细胞等,并且经过体外传代扩增以后仍然能够保持这种干细胞特性。其次,间充质干细胞的来源广泛,在胎儿及成体的骨髓、骨膜、脂肪、乳牙、脐带等多种组织中均有存在,分离获取间充质干细胞不需要破坏囊胚,因而不存在伦理道德问题。再者,间充质干细胞还具有免疫调节功能,可以通过细胞间的相互作用及产生细胞因子抑制T细胞的增殖及其免疫反应,从而发挥免疫重建的功能,进行自体移植也不存在免疫排斥反应,并且已经有许多研究结果显示成体干细胞治疗不会引发畸胎瘤。间充质干细胞在骨髓中含量最高,但也仅占有核细胞的0.001%-0.01%。目前分离间充质干细胞的方法主要有：全骨髓贴壁筛选法、密度梯度离心法、流式细胞仪分选法和免疫磁珠法,前两种方法操作简便,但仅用其中一种方法很难实现细胞的纯化,从而对实验研究产生不良的影响,后两种方法分离出来的细胞纯度较高,但操作过程复杂,费用昂贵,不能得到广泛推广。目前多采用密度梯度离心联合贴壁筛选的方法分离纯化骨髓间充质干细胞,但这种方法分离出来的间充质干细胞的纯度如何,细胞经过传代以后的活力是否发生变化,目前缺乏较为系统而全面的评估。体内、外的许多研究显示间充质干细胞可以分化为血管内皮细胞,其中血管内皮细胞生长因子在此过程中发挥主要作用,碱性成纤维细胞生长因子可以创造有利于间充质干细胞向血管内皮细胞分化的微环境,具有协同诱导的作用,这两种因子是目前体外内皮化诱导最常用的组合。酸性成纤维细胞生长因子与碱性成纤维细胞生长因子的生物学功能相似,并且在酸性环境中其生物活性发挥的更好。在诱导分化过程中,细胞代谢会引起培养液的PH值降低,酸性成纤维细胞生长因子有可能更好的协助血管内皮细胞生长因子诱导间充质干细胞可以分化为血管内皮细胞。第一章：兔骨髓间充质干细胞的分离培养、鉴定及活力检测目的体外分离出兔骨髓间充质干细胞,进行形态学、细胞表型及分化潜能的鉴定,并对传代后细胞的活力进行检测和比较。方法1、骨髓间充质干细胞的分离、纯化：在无菌条件下抽取兔子股骨和胫骨的骨髓,采取密度梯度离心的方法把骨髓中比重不同的细胞群分层,然后分离出含有骨髓间充质干细胞的单个核细胞,置于37℃、5%C02、饱和湿度的培养箱中常规培养,通过换液去除未贴壁的细胞,并且在传代过程中利用骨髓间充质干细胞易于消化的特点,严格控制胰蛋白酶的量和消化时间,去除贴壁能力较强的单核细胞及成纤维细胞,从而实现骨髓间充质干细胞的纯化。2、骨髓间充质干细胞的鉴定：(1)形态学：倒置显微镜下观察细胞在不同时期的形态特征,并进行苏木素—伊红染色。(2)细胞表型：应用流式细胞仪检测CD14、CD29、CD34、CD44、CD45以及CD90的表达。(3)分化潜能：应用成骨诱导培养液诱导间充质干细胞分化为成骨细胞,并进行茜素红染色鉴定钙质结节；应用成脂诱导培养液诱导间充质干细胞分化为脂肪细胞,并进行油红O染色鉴定脂肪细胞。3、细胞活力的检测(1)描绘细胞生长曲线：选取P1、P3、P5代生长状况良好的细胞以相同细胞数量接种于直径为3.5cm的培养皿内,自第2d起每天取3个培养皿消化计数,每皿计数3次,取其平均值,连续8d。以时间为横轴,细胞数为纵轴,绘制生长曲线。(2)计算细胞接种存活率：选取P1、P3、P5代处于对数生长期的细胞,以3.5×107L-1的浓度接种于直径为3.5cm的培养皿中,每隔2h随机选取3个培养皿,弃去培养液与未贴壁细胞,用浓度为0.25%胰蛋白酶消化,计算每个皿内的细胞数量,取平均值,计算贴壁率,连续测定18h,以时间为横轴,贴壁率为纵轴,绘制曲线。(3)细胞克隆形成率：选取P1、P3、P5代处于对数生长期的细胞,消化后以100个/孔接种于6孔板中,连续培养16d,用台盼蓝染色后计数细胞克隆,标准为：细胞数≥50个记为为1个细胞克隆。结果1、形态特征：细胞在培养皿内贴壁生长,原代细胞的形态多呈圆形、梭形和三角形,5-6d可形成散在的细胞集落,8-10d集落之间相互融合,细胞呈鱼群状排列。经过贴壁筛选,细胞的同质性和均一性逐渐提高。2、细胞表型：流式细胞仪检测结果显示：细胞CD29、CD44、CD90的表达率分别为97.21%、98.87%和96.20%；CD14、CD34、CD45表达率分别为5.36%、0.36%和2.03%。3、分化潜能：成骨诱导21d,实验组可形成明显的钙质结节,茜素红染色后见钙结节呈深红色,对照组无明显改变。成脂诱导14d,实验组细胞呈圆形或多边形,细胞质内可见明显脂滴形成,油红0染色呈现鲜艳的红色,对照组未见明显变化。4、生长曲线：P1、P3代细胞的生长曲线形态相似,均呈现出典型的“S”形,相同时间内P5代细胞的增殖速度相对缓慢。5、细胞接种存活率：P1、P3代细胞贴壁率的变化基本一致,接种14h后贴壁率可达到96%,P5代细胞的贴壁率较P1、P3代细胞明显低,接种14h后的贴壁率仅为87%,统计分析提示P1、P3代细胞贴壁率的差异无统计学意义(P>0.05),P5代细胞与P1、P3代细胞之间的差异有统计学意义(P<0.01)。6、细胞克隆形成率：P1、P3、P5代细胞均可形成细胞克隆,显微镜下可见克隆内的细胞排列紧密,形态与原代细胞近似,克隆周边可见散在的老化或变异的细胞。细胞克隆形成率在P1、P3、P5代细胞之间的差异具有显著性(P<0.01),随着传代次数增加克隆形成率逐渐降低。结论1、密度梯度离心法能够分离出具有多向分化潜能的骨髓间充质干细胞,经过贴壁筛选可以实现细胞的进一步纯化。2、密度梯度离心联合贴壁筛选的方法分离出的骨髓间充质干细胞在P1至P3代能够保持良好的细胞活力；随着扩增传代,细胞活力会有不同程度的下降。3、基于骨髓间充质干细胞的组织工程研究适宜在P1至P3代以内进行,这样能够保证细胞与支架的良好贴附,为进一步的临床治疗奠定基础。第二章：诱导骨髓间充质干细胞分化为血管内皮细胞：aFGF与bFGF生物活性的比较目的VEGF分别与bFGF、aFGF联合诱导骨髓间充质干细胞分化为血管内皮细胞,通过细胞形态学、摄取功能、检测CD31表达率及NO分泌量鉴定血管内皮细胞,并统计分析两种因子组合在诱导效率方面的差异。方法1、兔骨髓间充质干细胞的分离培养及鉴定：同第一部分。2、诱导骨髓间充质干细胞分化为血管内皮细胞：选取P3代生长状况良好的细胞,接种于6孔板中。实验组应用含VEGF (20ng/ml), aFGF (10ng/ml)的培养液诱导,对照组应用含VEGF (20ng/ml)、bFGF (10ng/ml)的培养液诱导。3、血管内皮细胞的鉴定(1)在倒置显微镜下观察诱导前后细胞的形态变化。(2)摄取功能：采用摄取Dil标记的乙酰化低密度脂蛋白(Dil-ac-LDL)和结合硫氰酸荧光素标记的结合荆豆凝集素(FITC-UEA-1)的双染色方法进行鉴定。荧光显微镜下观察,摄取Dil-ac-LDL的细胞散发出红色荧光,结合FITC-UEA-I的细胞散发出绿色荧光,荧光染色双阳性的细胞呈黄色,是具有摄取功能的内皮细胞。(3)CD31表达率：两种因子组合诱导培养第15d和第24d,应用流式细胞仪检测细胞表面CD31的表达。(4)NO分泌量的检测：诱导第15d和第24d,取上清液,储存于-80℃冰箱内。按照NO检测试剂盒的说明书进行操作,以平均吸光度OD值为x轴,标准品浓度为y轴,用Excel作图得到标准曲线公式,将样品OD值代入公式计算NO浓度。结果1、骨髓间充质干细胞形态及鉴定：同第一部分。2、内皮细胞鉴定(1)形态学观察：经过诱导以后,细胞体积变小,形态为圆形、椭圆形或短梭形,形态饱满,立体感增强。24d后,细胞呈现典型的“铺路石”样表现。(2)摄取功能：诱导的细胞经过荧光染色,显微镜下可见双染色阳性的细胞大于50%。(3)CD31的表达：诱导第15d,实验组和对照组CD31的表达率分别为(34.20±2.90)%和(46.23±2.87)%,两样本t检验比较差异具有显著性(P<0.01),对照组的表达率较高；诱导第24d,实验组和对照组CD31的表达率分别为(53.35±2.12)%和(56.14±3.93)%,两样本t检验比较差异没有显著性(P>0.05)。(4)NO分泌量的检测：诱导第15d,实验组和对照组NO的分泌量分别为(70.27±3.45)μmol/L和(79.19±5.34)μmol/L两样本t检验比较差异具有显著性(P<0.01),对照组NO的分泌量较高；诱导第15d,实验组和对照组NO的分泌量分别为(105.16±5.89)μmol/L和(109.97±5.99)μmol/,L两样本t检验比较提示差异没有显著性(P>0.05)。结论1. VEGF+bFGF和VEGF+aFGF两种因子组合均可诱导骨髓间充质干细胞分化为成熟的血管内皮细胞,并且两种方案的最终诱导效率没有差别。2、在诱导骨髓间充质干细胞分化为血管内皮细胞的过程中,bFGF比aFGF更容易受到细胞代谢活动的影响。