本研究在原有的工作基础上，将进一步对HCMV引起血小板减少症的分子机制进行阐明。 研究材料：材料CHRF-288-11细胞株由香港中文大学儿科系实验室提供。HCMVAD169株由中国武汉病毒研究所提供，效价为10-6TCD50/ml。批号为20040625。 研究方法：CHRF-288-11细胞株用含10％FBS、100单位/ml青霉素、100μg/ml链霉素的MeM培养液，在37℃、5％CO2条件下培养，每周换液2次，传代1次。取对数增殖期细胞作实验。HCMV原液直接感染CHRF细胞株。使其终浓度分别为原液的1/10000即10-4、1/1000即10-3、3/1000即3×10-3和1/100即10-2，并设立空白对照组。用RT-PCR观察鉴定HCMV是否能直接感染CHRF细胞株；用MTT法检测各实验组的细胞存活率；用Hoechst核染色、DNA片段琼脂糖凝胶电泳、流式细胞仪分析细胞亚二倍体峰等进行分析HCMV感染CHRF细胞株后诱导凋亡的特征；用Western-Blotting免疫印迹和各种特异性的阻断剂分析HCMV介导凋亡的信号机制。 研究结果： 1.HCMV能直接感染CHRF细胞RT-PCR扩增特异IE基因，扩增产物在2％的琼脂糖凝胶中电泳，通过紫外凝胶成像，各HCMV感染组均可见一条特异性扩增条带，而空白对照组未见阳性条带。 2.HCMV诱导CHRF细胞生长抑制和凋亡体外培养CHRF细胞经10-2HCMV直接感染后，用MTT，PI单染流式细胞，Hoechst33258核染色等方法于HCMV感染后的第2天、第4天和第6天分别检测。 检测结果表明：感染后时间依赖性地细胞存活率显著降低，G1期前的亚二倍体峰(凋亡率)显著增加，细胞核固缩核碎裂现象增加。在相同培养条件下，用10-4、10-3和10-2浓度的HCMV感染CHRF细胞，于感染后第4天用MTT，PI单染流式细胞，Hoechst33258核染色和DNA凝胶电泳等法检测。检测结果表明：HCMV浓度依赖性地降低CHRF细胞存活率，增加CHRF细胞的凋亡率，诱导CHRF细胞核固缩核碎裂增加，DNA梯样条带。 3.Caspase-3的激活参与HCMVAD169株诱导的CHRF细胞凋亡CHRF感染组CHRF细胞内总caspase-3(35kd)量逐渐减少，而活化态的caspase-3片段(19或17KD)显著增加。Caspase-3特异抑制剂Z-VAD-FMK在HCMV感染CHRF细胞后12h加入处理组，于感染后第4天用MTT法检测细胞存活率，结果发现caspase-3特异抑制剂Z-VAD-FMK抑制HCMV降低的CHRF细胞存活率。 4.抑制ERK通路介导HCMV抑制CHRF细胞的增殖用10-2HCMV感染CHRF细胞，于指定的时间收集各时间点的蛋白，用Westernblotting检测，结果显示：与空白对照组相比，HCMV处理组随着感染时间延长ERK1/2磷酸化水平逐渐降低；用ERK通路的特异抑制剂PD98059加入CHRF细胞，显示其可抑制ERK1/2磷酸化水平；该过程中ERK1/2蛋白总量不变。同时，PD98059可降低CHRF细胞存活率。 5.激活c-Jun通路介导HCMV诱导的CHRF细胞的凋亡用10-2HCMV感染CHRF细胞后，于指定的时间收集各时间点的蛋白，用Westernblotting检测，结果显示：与空白对照组相比，HCMV感染组随着感染时间延长CHRF细胞内p-c-Jun和c-Jun逐渐增加；用JNK特异抑制剂SP600125可抑制HCMV增加的p-c-Jun和c-Jun蛋白水平。同时，SP600125抑制HCMV降低的CHRF细胞存活率。 研究结论： 1.HCMVAD169株直接感染CHRF细胞并降低其存活率。 2.HCMVAD169株可以诱导典型的CHRF细胞的凋亡。 3.Caspase-3的激活参与HCMVAD169株诱导的CHRF细胞凋亡。 4.HCMV抑制ERK通路的活性可能是其抑制CHRF细胞增殖的主要分子基础。 5.激活c-Jun通路的活性可能是HCMV导致CHRF细胞凋亡的主要分子基础。 6.HCMV感染巨核系细胞诱导其凋亡可能是血小板减少症的发病机制之一，干预特定的通路抑制凋亡的发生为临床治疗HCMV感染引起的血小板减少症寻找有效的药物提供可靠的理论依据。