【摘 要】
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[目的]探讨转甲状腺素蛋白（Transthyretin,TTR）在糖尿病小脑损伤中的作用,从形态及分子水平研究小脑神经元和星形胶质细胞在高糖刺激下的变化及其影响因素,初步阐明TTR与糖尿病小脑损伤的关系及分子机制。[方法]SD大鼠腹腔注射链脲佐菌素（Streptozocin,STZ）,建立糖尿病（Diabetes Mellitus,DM）模型。造模后第九周取小脑组织进行转录组学筛查分析、行为学测试
【基金项目】
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国家自然科学基金资助项目（82060157）； 国家自然科学基金资助项目（32060184）；
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[目的]探讨转甲状腺素蛋白（Transthyretin,TTR）在糖尿病小脑损伤中的作用,从形态及分子水平研究小脑神经元和星形胶质细胞在高糖刺激下的变化及其影响因素,初步阐明TTR与糖尿病小脑损伤的关系及分子机制。[方法]SD大鼠腹腔注射链脲佐菌素（Streptozocin,STZ）,建立糖尿病（Diabetes Mellitus,DM）模型。造模后第九周取小脑组织进行转录组学筛查分析、行为学测试、苏木素-伊红染色（Hematoxylin-Eosin staining,HE）、尼氏染色和免疫荧光双标实验。取出生24小时内的SD大鼠小脑,进行体外原代神经元和原代星形胶质细胞培养,对两种原代细胞染色鉴定,细胞增殖-毒性检测（Cell Counting Kit-8,CCK-8）实验验证高糖对神经元和星形胶质细胞的影响,蛋白免疫印迹（Western blotting,WB）、免疫组化、免疫荧光实验检测目的因子TTR的表达变化,刚果红染色观察淀粉样物质的变化,探索TTR稳定剂Diflunisal的最适浓度,验证Diflunisal对TTR蛋白解聚的稳定作用。[结 果]转录组学筛查基因总数为16535个,与正常对照（Normal Control,NC）组相比,DM组的差异表达基因中186个基因上调,226个下调,其中TTR的差异最大;行为学测试结果发现,DM组在平衡木上停留的时间比NC组缩短（P＜0.01）,通过横杆的时间比NC组延长（P＜0.01）;HE染色和尼氏染色显示,DM组小脑浦肯野细胞层排列紊乱,神经元丢失,间质水肿,颗粒层细胞密度降低,分布不均;免疫荧光双标染色发现TTR表达定位于小脑的神经元及星形胶质细胞,但与小胶质细胞无共定位,DM组小脑组织中TTR表达量升高。CCK-8检测结果发现,原代神经元在高糖浓度达到50mM后细胞存活率开始降低（P＜0.05）,甘露醇组细胞存活率无统计学差异（P＞0.05）;原代星形胶质细胞100mM高糖组相比NC组的细胞存活率降低（P＜0.01）,低浓度的高糖刺激对星形胶质细胞有促进增殖的作用（P＜0.05）。Western blotting实验显示,原代神经元TTR蛋白表达水平在NC组和高糖组之间无统计学意义（P＞0.05）;原代星形胶质细胞高糖组TTR四聚体表达水平较NC组减少（P＜0.01）,TTR单体表达水平增加（P＜0.01）,NC组与甘露醇组无统计学差异（P＞0.05）,使用TTR稳定剂Diflunisal后四聚体的解聚减少（P＜0.05）,且单体的生成减少（P＜0.05）。免疫组化染色结果发现,TTR在原代星形胶质细胞上有表达,高糖组的TTR阳性表达率较NC组增强（P＜0.05）;刚果红染色结果显示NC组、甘露醇组和高糖组均有少量的砖红色淀粉样物质,但各组间无统计学意义（P＞0.05）;免疫荧光双标实验显示原代神经元TTR在NC组和高糖组均有表达,TTR与神经元的细胞质共定位明显,但是各组之间的荧光信号强度无统计学差异（P＞0.05）;TTR在NC组和高糖组的原代星形胶质细胞上均有表达,随着高糖浓度的升高,TTR荧光信号强度增强（P＜0.01）,TTR在星形胶质细胞的细胞核及细胞质均有明显的共定位。[结 论]1、TTR与糖尿病造成的浦肯野细胞损伤和小脑功能障碍密切相关。2、TTR解聚可能通过活化星形胶质细胞导致浦肯野细胞损伤,而非直接作用于神经元。3、TTR稳定剂Diflunisal可以抑制TTR解聚。
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