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目的:肌肉组织除发挥运动等功能外,还是一种重要的分泌器官。由肌肉组织分泌的细胞因子统称为肌因子(myokines),有研究表明肌因子具有调节机体脂代谢的作用,其中FGF21和Irisin在体外及动物实验中对肥胖改善显著。目前采用将其过表达或直接注射外源重组蛋白而达到改善肥胖的目的。但由于过表达时扰乱了机体原有的平衡以及重组蛋白制备成本高昂,限制了临床上的应用。近年出现的基因编辑技术CRISPR/dCas9为肌因子的临床应用提供了一种新的解决方案,该技术可在不改变基因组结构的前提下实现在体基因的激活或抑制。本研究中我们应用CRISPRa系统调控内源性肌因子的表达和分泌,进而调节脂肪细胞褐变,使其有希望成为肥胖症及相关代谢疾病的新治疗方法。
方法:我们首先在体外将带有sgRNA的CRISPRa系统包装成慢病毒感染小鼠成纤维细胞NIH3T3,筛选出上调FGF21和Irisin表达效率最佳的sgRNA序列;然后利用选出的sgRNA的病毒感染成肌细胞系C2C12进行内源性基因表达验证;再检测激活FGF21和Irisin的C2C12细胞的条件培养基对脂肪前体细胞3T3-L1成脂分化的影响。接下来我们在体内验证中构建CRISPRa系统的AAV载体,包装并纯化AAV病毒通过尾静脉注射注入C57小鼠检测肌肉组织及血清中Irisin和FGF21的表达变化。最后在肥胖模型鼠中注入病毒观察代谢调节情况。
结果:
1)肌细胞系可以表达并分泌Irisin和FGF21;
2)CRISPRa系统可上调内源性Irisin和FGF21的表达;
3)FGF21和Irisin的上调可促进肌细胞的分化发育;
4)CRISPRa系统上调后的Irisin和FGF21的条件培养基可促进脂肪细胞的分解,且FGF21可以使脂肪细胞发生褐变;
5)通过小鼠尾静脉注射,基于AAV9的CRISPRa系统可在体高效转导;
6)AAV9-CRISPRa系统在体内无明显毒副作用。
结论:我们基于CRISPRa系统对FGF21和Irisin两个肌因子的调控可在体外促进脂肪细胞的分解,为进一步研究其与脂肪组织的相互作用奠定了基础,也为代谢疾病的预防和治疗提供了新的解决策略。
方法:我们首先在体外将带有sgRNA的CRISPRa系统包装成慢病毒感染小鼠成纤维细胞NIH3T3,筛选出上调FGF21和Irisin表达效率最佳的sgRNA序列;然后利用选出的sgRNA的病毒感染成肌细胞系C2C12进行内源性基因表达验证;再检测激活FGF21和Irisin的C2C12细胞的条件培养基对脂肪前体细胞3T3-L1成脂分化的影响。接下来我们在体内验证中构建CRISPRa系统的AAV载体,包装并纯化AAV病毒通过尾静脉注射注入C57小鼠检测肌肉组织及血清中Irisin和FGF21的表达变化。最后在肥胖模型鼠中注入病毒观察代谢调节情况。
结果:
1)肌细胞系可以表达并分泌Irisin和FGF21;
2)CRISPRa系统可上调内源性Irisin和FGF21的表达;
3)FGF21和Irisin的上调可促进肌细胞的分化发育;
4)CRISPRa系统上调后的Irisin和FGF21的条件培养基可促进脂肪细胞的分解,且FGF21可以使脂肪细胞发生褐变;
5)通过小鼠尾静脉注射,基于AAV9的CRISPRa系统可在体高效转导;
6)AAV9-CRISPRa系统在体内无明显毒副作用。
结论:我们基于CRISPRa系统对FGF21和Irisin两个肌因子的调控可在体外促进脂肪细胞的分解,为进一步研究其与脂肪组织的相互作用奠定了基础,也为代谢疾病的预防和治疗提供了新的解决策略。