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茶树（Camellia sinensis（L.）O.Kuntze）是山茶科山茶属植物,原产于中国西南地区,目前在世界范围内广泛种植。茶叶已成为世界上仅次于水的第二大饮品,具有丰富的滋味并对人体健康有诸多益处。L-茶氨酸是茶树体内重要的次生代谢产物之一,是构成茶叶鲜爽味的主体物质。L-茶氨酸具有安神、提高学习和免疫系统能力、影响体重、预防癌症等作用。虽然L-茶氨酸合成途径中的关键基因已有报道,但对关键基因转录调控机制的研究较少。本文分析了“保靖黄金茶1号（Baojing Huangjincha 1,BJ）”和“白叶1号（Baiye 1,BY）”不同生长时期叶片中游离氨基酸的积累模式,并基于RNA-sequencing技术构建了“BJ”和“BY”不同生长阶段叶片的转录组文库。进一步筛选和鉴定了与L-茶氨酸生物合成相关的CsMYBs转录因子。通过TA克隆获得CsMYB73和CsMYB38的全长c DNA序列,利用分子生物学相关方法验证了CsMYB73和CsMYB38转录因子对L-茶氨酸生物合成关键基因的转录调控作用。主要的研究结果如下:1通过茚三酮显色法检测“BJ”和“BY”不同生长时期叶片中游离氨基酸的总量。结果表明,“BJ”和“BY”幼嫩叶片中游离氨基酸含量较高,分别可达67.85和78.89 mg/g,并随着叶片成熟度升高而逐渐降低。利用柱前衍生高效液相色谱法测定了样品中氨基酸组分（Glu、Ala和L-theanine）的含量,结果表明,样品中的L-茶氨酸含量最高,在“BJ”和“BY”叶片中平均为18.29和16.88 mg/g;Glu的含量次之,在“BJ”和“BY”叶片中平均为3.08和3.55 mg/g;样品中Ala的平均含量最低,在两个品种中分别仅为0.18和0.29 mg/g。“BJ”品种中,生长旺盛期叶片（4w）的Glu、Ala和L-theanine积累量均为最高,而“BY”的幼嫩叶片（1w）中Glu、Ala和L-theanine的含量最高。在两个品种中,生长阶段为7w的叶片中游离氨基酸总量和氨基酸组分的含量均为最低。2通过RNA-sequencing技术构建了“BJ”和“BY”不同生长时期叶片的转录组文库,共获得925 172 206条clean reads,与参考基因组的平均比对率高达88.87%。从转录组数据库中筛选了25个L-茶氨酸代谢相关的DEGs,涉及14个L-茶氨酸合成相关KEGG通路。基因表达模式分析结果表明,多数L-茶氨酸代谢相关的DEGs在叶片生长过程中下调表达,并与游离氨基酸的积累量呈正相关。通过q RT-PCR对11个L-茶氨酸代谢相关的DEGs进行相对表达量验证,结果表明这些基因的相对表达量在叶片发育过程中普遍呈下调趋势。蛋白互作预测显示,L-茶氨酸生物合成相关DEGs之间存在互作关系,CsGS、CsGOGAT-Fd和CsGDH2在互作网路中的中心度较高,推测这些蛋白可能在L-茶氨酸合成途径中具有核心的调控功能。3基于不同生长阶段茶树叶片的转录组数据,筛选和鉴定了20个与L-茶氨酸生物合成相关的CsMYBs转录因子。通过保守结构域和氨基酸序列比对分析,可将候选CsMYBs分为1R-MYB和R2R3-MYB亚家族。多数CsMYBs基因的表达谱随着叶片成熟度的升高呈下降趋势,与游离氨基酸积累量呈正相关;通过q RT-PCR验证6个CsMYBs的相对表达量,结果表明CsMYB73和CsMYB38的相对表达量在“BJ”和“BY”品种中随着叶片成熟度的增加而显著上调;CsMYB12和CsMYB4在两个品种中的相对表达量随着叶片生长发育显著下调。蛋白互作网络分析表明,CsMYB5、CsMYB12和CsMYB94可能与b HLH和WD40蛋白形成复合物,协同调控L-茶氨酸的生物合成。结构基因的启动子区域具有丰富的MYB转录因子结合位点,推测CsMYBs可能通过与结构基因的启动子区域结合,进而参与L-茶氨酸的代谢过程。4 CsMYB73和CsMYB38,均属于R2R3-MYB的22亚组,通过TA克隆,获得全长c DNA。构建重组CsMYB73-GFP和CsMYB38-GFP重组质粒并在烟草体内表达,结果表明CsMYB73和CsMYB38是典型的核定位蛋白。分别构建p GBKT7-CsMYB73和pGBKT7-CsMYB38重组载体在酵母体内检验CsMYB73和CsMYB38蛋白的转录活性,结果表明CsMYB73不具有自激活活性,而CsMYB38在酵母细胞内具有自激活活性。通过原核表达和蛋白纯化技术,获得GST-CsMYB73和GST-CsMYB38融合蛋白,利用EMSA试验证实仅发现CsMYB73能够体外结合CsGS1、CsGS2和CsGDH2的启动子区域。双荧光素酶报告基因系统分析表明,共转CsGS1 pro-LUC/p EAQ-CsMYB73、CsGS2pro-LUC/p EAQ-CsMYB73和CsGDH2 pro-LUC/p EAQ-CsMYB73的烟草细胞内LUC/REN的相对强度明显低于对照组,表明CsMYB73能够抑制CsGS1、CsGS2和CsGDH2启动子的转录活性;共转入CsGS1 pro-LUC/p EAQ-CsMYB38和CsGS2 pro-LUC/p EAQ-CsMYB38的烟草细胞内LUC/REN的相对强度明显低于对照组,而共转入CsGDH2 pro-LUC/p EAQ-CsMYB38的烟草细胞内LUC/REN的相对强度显著高于对照组,表明CsMYB38能够抑制CsGS1和CsGS2启动子的转录活性,并刺激CsGDH2启动子的活性。基于这些结果,推测CsMYB73可能通过抑制CsGS1、CsGS2和CsGDH2的转录表达,促进从而负调节L-茶氨酸的代谢过程;而CsMYB38一方面抑制了CsGS1、CsGS2的表达,另一方面能够激活CsGDH2基因的表达,在L-茶氨酸的代谢过程具较复杂的调控作用。