研究背景鼻咽癌（NPC）是我国南方及东南亚各国发病率高,危害大的恶性肿瘤之一,严重威胁和影响人们的生命健康和生活质量。目前,临床仍以放射治疗或放化疗的联合治疗作为鼻咽癌治疗的首选方法,虽然近年来放疗设备、技术及方法在不断的进步,使鼻咽癌的5年生存率、治愈率提高到70%左右,但放化疗本身带来的局部及全身副反应也给病人造成了身体及心理上的极大伤害,严重影响了治疗效果。此外,临床上相当一部分患者对放化疗产生耐药性,肿瘤产生耐药性是导致肿瘤复发及残留的重要原因。因此,进一步探索鼻咽癌的病因,耐药性原因及机制并针对其研究新的抗耐药的有效治疗方法尤为重要。肿瘤细胞多药耐药性（MDR）是指细胞先天拥有或者后天获得对结构和功能均不同的化疗药物的耐药性,是存在于多数肿瘤细胞中的特点。先天性或者后天性的多药耐药性是肿瘤治疗过程中的问题。研究MDR的分子机制,对于提高鼻咽癌临床治愈率及生存率极为重要。ABC转运蛋白家族,即耗能流出泵,ABC转运家族有48个成员,其中ABCG2,MRP1和P-gp这三个成员与肿瘤细胞的多药耐药性密切相关,基本可以解释目前已知细胞系的多药耐药性,其中ABCG2为研究热点之一。人类ABCG2基因定位于4q21-22,编码一段含655个氨基酸的多肽,分子量大约为72KD。ABCG2跟ABC转运蛋白家族其他成员一样,可以转运多种底物进出细胞。ABCG2的底物包括代谢产物、药物、毒性物质、内源性脂质、多糖、核苷酸、类固醇等等。能量依赖性药泵,能将多种结构和作用机制不同药物排出细胞外,因而产生多药耐药。肿瘤干细胞理论（TSCs）认为,肿瘤组织中有极少量的细胞具有自我更新能力,这些细胞称为肿瘤干细胞。迄今为止,随着对肿瘤干细胞特性的深入研究发现,肿瘤干细胞具有自我保护的能力,肿瘤干细胞处于休眠期形成多药耐药的特性。2009年国内有学者采用流式细胞术（FACS）,和免疫磁珠分选术（MACS）对鼻咽癌CD133+进行分选。免疫磁珠分选方法简便易行,但分离效率及精确度均较流式细胞仪分选略低,适合对细胞纯度要求不高的分选。流式细胞仪分选纯度较高、回收率高,适应于低含量细胞的分选,但是,由于流式细胞仪操作较复杂,对设备操作人员的熟练操作程度及经验非常相关。因此,目前多采用免疫磁珠分选方法。本文也将采用免疫磁珠分选技术对鼻咽癌细胞株CNE-2进行分选。杨转移等人采用免疫磁珠法从U251细胞中分选肿瘤干细胞（U251-CSC）后,MTT比色试验法观察化疗药物替尼泊苷（Vm-26）、卡莫司汀（BCNU）和顺铂（DDP）对U251和U251-CSC的增殖抑制作用,并进一步采用Western blot免疫印迹法检测3种耐药酶LRP、MGMT和Topo Ⅱ α的表达,来检测脑胶质瘤肿瘤干细胞中耐药性。肿瘤干细胞表面表达的ABC转运蛋白与MDR有关,为探讨肿瘤干细胞与肿瘤多药耐药之间的关系,本研究以鼻咽癌细胞株CNE-2为研究对象,采用免疫磁珠分选的方法进行肿瘤干细胞的分选及鉴定,检测耐药基因ABCG2的表达水平。研究目的1.鼻咽癌CNE-2细胞株存在肿瘤干细胞样亚群,初步探讨肿瘤干细胞的生物学特性。2.检测ABCG2在鼻咽癌细胞株CNE-2 CD 133+细胞与CD133-细胞中表达的差异。3.鼻咽癌细胞株CNE-2 CD133+细胞与CD133-细胞对药物顺铂、依托泊苷、紫杉醇及氯丙嗪的IC50的不同,比较两细胞株的多药耐药性。材料和方法1.流式细胞仪检测CNE-2细胞中CD 133的表达:计数约107个的CNE-2细胞,经胰酶消化处理,0.01%PBS洗涤,去上清、加入PE标记的CD133抗体10μL、FcR阻断剂20μL、buffer 80μL,充分混匀后避光4℃冷却10min,buffer洗涤、重悬、离心、去上清,加500μL buffer重悬细胞、上机分析。2.免疫磁珠技术分选CNE-2中鼻咽癌CD133+干细胞:取CNE-2细胞悬液,加入FcR阻断剂100μL,加入磁珠100μL,4℃孵育30min。用500μL buffer湿柱。加入细胞悬液,过磁珠分选柱收集未标记细胞。用buffer洗柱,收集流出液,与上述液体混合。将MS柱从磁珠分离器上移开,往柱中加入1ml buffer,用针芯快速将缓冲液推出,收集液体中含有CD133+细胞。所得的CD133+细胞离心,1000 rpm/min 5min,去上清,收集CD133+、CD133-细胞,加入无血清培养液,无血清培养液含DMEM/F12（1:1）、20ng/ml碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）、20ng/ml表皮生长因子（EGF）、5μg/ml胰岛素,放于37℃、5%CO2饱和温度的培养箱中培养,光学显微镜下观察CNE-2 CD133+干细胞与CNE-2未分选细胞二者形态学的差异。3.CCK-8法检测CD133+细胞体外增殖能力:将分选的CD133+细胞、CD133-细胞及未分选细胞种植于96孔板内,每孔加入0.2ml无血清培养液,2000细胞/孔（设空白组用于调零）。置于37℃、5%CO2饱和温度的培养箱中培养,每48h半量换液1次,在第12h、24h、48h、72h、96h测定细胞的增殖状态,以490nm吸光度A值量化活细胞数,每组所得数据取均值,以时间为横轴,A值为纵轴,绘制细胞生长曲线、比较3组细胞的增殖速度。实验结果以x±s表示,采用单因素重复测量的方差分析。4.体外成球实验检测CD133+细胞体外成球能力:配制无血清培养液,取分选后的CD133+细胞和CD133-细胞在上述无血清培养液中,置于37℃、5%CO2饱和温度的培养箱中培养,每天加入0.25 mL上述无血清培养液,观察肿瘤细胞克隆球形成过程,倒置显微镜观察并摄片。5.体外平板克隆形成实验检测CD133+细胞克隆形成能力:将分选的CD133+细胞、CD133-细胞进行细胞计数,以每200个细胞接种于含10ml上述无血清培养液的6孔板中,每种细胞3个复孔,置于37℃、5%CO2饱和温度的培养箱中培养2-3w。当6孔板中出现肉眼可见的克隆时终止培养,弃去培养液,用PBS小心浸洗2次,加纯甲醇固定15min。弃甲醇后空气干燥,加适量结晶紫室温固定15 min。洗去染料后再显微镜下计数大于50个细胞的克隆数,然后按下式计算克隆形成率:克隆形成率（%）=克隆数/接种细胞数×100%。实验重复3次。6.裸鼠体内成瘤试验检测CD133+细胞体内成瘤能力:8只裸鼠,雄性,4-6周龄,分为CD133+、CD133-2组,每只裸鼠注入细胞量为1×105。固定裸鼠,碘伏消毒背部皮肤,分别向皮下注射CD133+、CD133-细胞。移植后饲养于SPF级无菌净化室内。每周观察一次,测量肿瘤大小,观察4w后采用断颈法处死。处死后立即取出肿瘤,用10%福尔马林固定,HE染色确定病理类型。在普通光学显微镜下观察裸鼠移植瘤组织形态。7.用逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）技术检测ABCG2的表达:取对数生长的CNE-2 CD133+干细胞、CD133-细胞及CNE-2未分选细胞2x106个,用Trizol提取总RNA,溶于DEPC处理的水中,在核酸蛋白测定仪上检测总RNA浓度。在各组20μ1逆转录体系中加入总RNA提取物5μg,用M-MLV第一链cDNA合成试剂盒逆转录,按照说明书进行。每组各取2.0μl逆转录产物作为模板,使用Platinum?Taq DNA聚合酶试剂盒,进行PCR扩增。RT—PCR产物各5μL在1.5%琼脂糖凝胶上电泳30min,EB染色。用ABCG2和GAPDH灰度值比值作为ABCG2 mRNA的相对表达水平。实验重复3次,求得均数和标准差。8.免疫组织化学技术检测ABCG2蛋白在人鼻咽癌CD133+移植瘤组织中的表达。9.CCK-8法检测鼻咽癌细胞株CNE-2 CD133+干细胞和未分选细胞对顺铂、依托泊苷、紫杉醇及氯丙嗪的半数有效抑制浓度,即IC50的不同,计算耐药指数,验证CD133+细胞的耐药性。10.统计学分析:统计分析软件为SPSS13.0版。生长曲线、平板克隆实验均重复三次。计量资料以x±s表示。细胞增殖实验（CCK8法）采用单个重复测量因素的方差分析。平板克隆实验经正态性检验后符合正态分布但方差不齐,采用近似t检验。半定量RT-PCR实验的显著性检验采用One-Way ANOVA方差分析,参数比较显示方差不齐,采用基于方差不齐的近似F检验Welch法,方差不齐的多重比较用Dunnett’sT3法;药物敏感性检测（CCK8法）各个药物均采用两样本数据采用两独立样本t检验,方差不齐则采用方差不齐条件下的t检验结果。P＜0.05为差异具有显著性意义。研究结果1.流式细胞仪检测到CD133在CNE-2中仅有微量的表达,流式分析结果显示细胞株中比例表达在0.200%-2.590%之间。2.免疫磁珠分选CNE-2中的CD133+细胞后,立即在无血清培养液中培养,在无血清条件下细胞悬浮生长,培养10天后形成肿瘤细胞球体,球体折光性好,大小不一,从十几个细胞到几十个细胞不等。3.分选的CD133+细胞、CD133-细胞和未分选细胞种植于无血清培养液,同时加入生长因子bFGF、EGF、胰岛素刺激细胞增殖,观察比较三种细胞分别于第12h、24h、48h、72h、96h的体外增殖情况。采用单个重复测量因素的方差分析,进行三种细胞间的结果分析。结果发现组间差异有统计学意义（F=446.815,P=0.000）,CD133+组的细胞活性（0.803±0.480）高于其他两组,表明CD133+组的细胞增长幅度最大;不同时间点之间差异有统计学意义（F=34.486,P=0.000）,其中48h时间点之间差异无统计学意义（F=2.024,P=0.188）,72h、96h两个时间点之间有统计学意义（F=96.235,P=0.000;F=183.115,P=0.000）,三组细胞培养72h后CD133+细胞增长速度大于CD133-与未分选细胞;组别间与时间点之间存在交互效应（F=55.584,P=0.000）,说明各组间的差异随时间变化而增大。4.将分选的CD133+细胞、CD133-细胞种植于六孔板中,以每200个细胞接种于含10ml上述无血清培养液的6孔板中,每种细胞3个复孔,置于37℃、5%CO2饱和温度的培养箱中培养2-3w,检测两种细胞的体外克隆形成能力。通过计算得出平均克隆形成率分别为CD133-（3.864±0.809）%和CD133+细胞（18.029±3.409）%,经两独立样本t检验,两组细胞差异有统计学意义（P=0.000）。5.1×105个CD133+细胞在接种4w之后,可在7只裸鼠体内形成移植瘤;而1×105个CD133-细胞在裸鼠体内均未成瘤,CD133+细胞在裸鼠体内的成瘤率高于CD133-细胞,经统计学处理,采用四格表资料的χ2检验（n＜40）,采用四格表资料的Fisher确切概率法,两者差异具有统计学意义（χ2=12.444,P=0.001）。6.相对于CD133-细胞和未分选细胞,经RT-PCR检测,在mRNA水平CD133+细胞表达的ABCG2耐药基因水平（灰度值为2.374±0.090）,明显高于CD133-（0.687±0.006）和未分选细胞的表达量（1.005±0.027）,经 One-Way ONOVA 方差分析,两组细胞差异有统计学意义（P=0.000）。7.在人鼻咽癌CD133+移植瘤组织肿瘤细胞膜表面见ABCG2蛋白表达,胞浆也有部分表达,为棕黄色,阳性表达细胞有沿血管分布倾向。8.药物敏感试验结果显示,顺铂、紫杉醇和依托泊苷对未分选细胞CNE-2的半数抑制浓度（IC50值）（x±s）分别为（19.070±0.363）μg/ml、（3.304±0.356）μ g/ml、（105.201±7.218）μg/ml。顺铂、紫杉醇及依托泊苷对鼻咽癌CD133+细胞的半数抑制浓度（IC50值）分别为（455.278±22.342）μg/ml、（18.240±0.226）μg/ml、（596.502±10.021）μg/ml,对三种抗癌药物的耐药指数为 23.874、5.520、5.670。各个药物对两组细胞的IC50值均分别采用两独立样本T检验,各组间差异有统计学意义（P值分别为:P=0.001,P=0.000,P=0.000）。氯丙嗪对未分选细胞CNE-2和鼻咽癌CD133+细胞的半数抑制浓度（IC50值）分别为（219.313±20.197）μg/ml、（237.288±35.453）μg/ml,经两独立样本 T 检验,各组间差异无统计学意义（P=0.488）。结论1.鼻咽癌细胞株CNE-2中确实存在CD133的微量表达,其表达比例在0.200%-2.590%之间。2.用免疫磁珠分选技术成功获得CD133+细胞,在无血清培养液中呈悬浮细胞球生长,为进一步研究CD133+细胞的生物学特性奠定了基础。3.CD133+细胞与CD133-细胞的体外生物学功能存在明显差异,CD133+细胞具有自我更新及增殖、形成干细胞球等干细胞样特性。4.CD133+细胞表达的ABCG2耐药基因和明显高于CD133-和未分选细胞。5.鼻咽癌细胞株CNE-2 CD133+细胞对顺铂、紫杉醇及依托泊苷有耐药作用,其中对顺铂耐药性最强。氯丙嗪对未分选细胞CNE-2和鼻咽癌CD133+细胞作用无差异,该特性可以作为研究氯丙嗪杀伤鼻咽癌CD133+细胞的基础,为进一步研究氯丙嗪的抗干细胞性提供了一定的依据。