研究背景尖锐湿疣（condyloma acuminatum,CA）是由人乳头瘤病毒引起的性传播疾病,常发生在肛门及外生殖器等部位。尖锐湿疣在全球范围内流行,据报道,在法国17-25岁年龄组性活跃人群中,HPV的检出率和高危型感染率最高,分别为22.1%和14.7%,其流行状态随年龄的增长而逐渐降低,我国统计资料表明2003年全国总报告发病率为56.66/10万,其中男性429,970例,占58.86%;女性300,480例,占41.14%,男女病例数之比为1.43:1。尖锐湿疣在7种报告性病中排第三位,占21.21%。尖锐湿疣的病原体是人乳头瘤病毒（human papilloma virus,HPV）,是一种DNA病毒,人体是HPV在自然界唯一的宿主,能引起人类皮肤和粘膜的鳞状上皮增殖。目前,通过分子生物学技术可将HPV分为100多种亚型,不同型HPV感染可以引起不同的临床表现,引起尖锐湿疣的主要是HPV-6、11、16、18、31、32、33、35、39、42、43、44、51、52、53、54 等型,根据与癌症的关系 HPV进一步可分为低危型与高危型,低危型主要包括6、11、42、43、44等型,高危型主要包括16、18、31、33、35、39、51、51等型。近年来大量文献资料及基础临床研究已充分表明HPV在生殖器癌的发生中具有致病作用。特别是女性宫颈癌、宫颈上皮内高度病变（CINⅡ/Ⅲ）的发生与HPV的感染密切相关。目前尖锐湿疣的治疗尚无确切的单一疗法,临床上主要采用局部用药、物理方法、手术、全身治疗以及近年来新兴的光动力疗法、HPV疫苗疗法等。由于各种治疗方法均不能彻底有效的清除HPV感染及防止疾病复发,尖锐湿疣给患者及患者家庭带来沉重的经济、心理负担,造成不良的社会影响。尖锐湿疣的确切治疗、如何减少复发及防止癌变是目前医学界急需解决的重大问题。鬼臼毒素（POD）是从鬼臼属植物---华鬼臼的根和茎中提取到的木脂类细胞毒药物成份,主要用于抗肿瘤及抗病毒。世界卫生组织（WHO）推荐治疗CA的一线药物中包括0.5%鬼臼毒素酊,但把0.5%鬼臼毒素酊作用于龟头、肛门、阴道、宫颈粘膜时具有较大刺激性,同时在生殖道内作用时间相对较短,对HPV的亚临床感染及潜伏感染作用不明显,机体大量吸收后可能会导致严重的不良后果,包括头晕、恶心、呕吐、腹泻、腹痛、血小板减少、白细胞降低、肝功能异常、共济失调及外周神经麻痹等,限制了其在临床进一步应用。为了克服鬼臼毒素在阴道、宫颈等粘膜部位HPV感染应用的局限性,更好的发挥其抗HPV感染的作用,需要对其加以改进,使其能适用于阴道、宫颈等粘膜部位的尖锐湿疣及HPV的亚临床感染与潜伏感染。纳米载药系统（nanopartice drug carrier,NDC）是指由药物及生物医学材料构成的粒径在1-1000nm范围内的药物输送系统。具有改善药物的理化性质、降低药物的毒副作用、实现靶向给药、控缓释等作用。20世纪90年代广泛研究的固体脂质纳米粒（solid lipid nanopart icles,SLN）是一种新型胶体载药系统,相比于其他载体系统,它具有物理稳定性较高、药物不易被降解、生物组织相容性好、靶向性、控缓释性良好等特点。但是SLN也有其不足,主要包括:载药能力有限;药物在贮存过程中的泄漏;其水分散体中水分含量过。纳米脂质载体（Nanostructured lipid carriers,NLC）,是 2000 年以后在固体脂质纳米粒基础上的第二代脂质纳米粒子。由于NLC是由固态脂质和与其空间不相容的液态脂质混合组成,因而使其具有了独特的纳米结构,提高了载药量。NLC既具有SLN的优点又克服了 SLN的缺点,其规模化生产的技术已经成熟且成本较低,此外还在可降解性和长期稳定性等多个方面显示出优势,因此是一种具有良好发展前景的新型药物载体制剂。南方医科大学南方医院皮肤性病科曾抗教授带领的团队长期从事鬼臼毒素新剂型的研究,发现鬼臼毒素经纳米药物载体包裹后具有良好的皮肤靶向性及彻底清除HPV感染的能力。国内外对粘膜部位尖锐湿疣及HPV潜伏感染的靶向治疗研究较少,但国外已有抗HIV粘膜靶向纳米制剂的成功的报道。因此我们在本课题组长期研究的基础上结合NLC的优点,将NLC作为药物载体,通过低温固化-乳化蒸发法制备了药物浓度为0.5%的鬼臼毒素纳米脂质载体（Podophyllotoxin-Nanostructured lipid carriers,POD-NLC）,并将其作用于永生化人阴道上皮细胞（VK2/E6E7）,研究鬼臼毒素纳米脂质载体对VK2/E6E7细胞的增殖抑制及凋亡诱导作用,从而为拓宽鬼臼毒素在临床的应用范围开辟一条新的途径,为新型纳米药物载体的基础及临床研究提供借鉴。研究目的1.为扩大鬼臼毒素的应用范围,制备鬼臼毒素质量浓度为0.5%的鬼臼毒素纳米脂质载体,并对该制剂的理化性质进行考察。2.以体外永生化人阴道上皮细胞（VK2/E6E7）为靶细胞,观察鬼臼毒素纳米脂质载体对VK2/E6E7细胞增殖抑制及诱导凋亡的作用。研究方法1.鬼臼毒素纳米脂质载体的制备和理化性质考察在制备方法上根据单因素考察和正交实验设计优化处方,以单硬脂酸甘油酯为固态脂质材料,以辛酸/葵酸三甘油酯为液态脂质材料,泊洛沙姆188为表面活性剂,采用改良的低温固化-乳化蒸发法制备鬼臼毒素纳米脂质载体,对其外观、粒径、包封率及稳定性等表征进行考察;通过马尔文粒径分析仪、扫描电镜观察纳米粒粒径大小和形态;高效液相色谱法测定纳米粒中鬼臼毒素的包封率。2.鬼臼毒素纳米脂质载体对永生化人阴道上皮细胞增殖和凋亡的影响（1）POD-NLC对VK2/E6E7细胞增殖的影响。设置POD-NLC浓度梯度为0.0005μg/ml、0.005μg/ml、0.05μg/ml、0.5μg/ml、5μg/m,分别处理VK2/E6E724h,48h,72h后CCK8检测各孔OD值,并计算抑制率。实验重复三次,每次每个浓度设置3个复孔。（2）不同剂型的POD对VK2/E6E7细胞生长抑制作用比较。设置POD酊剂和POD-NLC浓度梯度为0.0005μg/ml、0.005μg/ml、0.05μg/ml、0.5μg/ml、5μg/m,分别处理VK2/E6E7 24h,48h,72h后CCK8检测各孔OD值,并计算抑制率。对POD酊剂和POD-NLC对VK2/E6E7细胞抑制率进行比较。实验重复三次,每次每个浓度设置3个复孔。（3）不同剂型的POD对VK2/E6E7细胞细胞周期阻滞作用的比较。实验组分别加入浓度为0.05μg/ml的POD和POD-NLC,对照组加入等体积的培养基,处理VK2/E6E7细胞24h,48h后,离心收集细胞,70%乙醇固定,PI染色后,流式细胞仪（FCM）检测,比较POD和POD-NLC对细胞周期阻滞的影响。（4）不同剂型的POD对VK2/E6E7细胞凋亡的影响。实验组分别加入含0.05μg/ml POD和POD-NLC的培养基,对照组加入等体积的培养基,处理VK2/E6E7细胞48h后,①倒置显微镜观察细胞的凋亡形态;②对细胞进行Hoechst33242染色后,荧光显微镜下观察细胞核凋亡形态;③用Annexin V-FITC/PI试剂盒检测细胞凋亡,根据试剂盒说明书对细胞进行染色后,进行流式细胞仪（FCM）检测。3.统计学处理采用SPSS13.0软件进行数据统计,数据以X ±SD表示,两组间均数比较采用独立样本t检验（Independent-Samples T Test）,分析各处理方式的主效应及交互效应采用重复测量的方差分析;多组间比较采用单因素方差分析（One-Way ANOVA）,Bonferroni法。方差不齐时分别采用Welch法和Tamhane’s T2检验。当P＜0.05时,差异显著,有统计学意义。结果1.制备的POD-NLC混悬液为质地均匀、略带淡蓝色乳光的半透明胶体状分散体系。电镜下POD-NLC基本呈球状或椭球形,大小基本一致,分布均匀。经马尔文型粒径分析仪检测POD-NLC混悬液平均粒径为为180±20nm,PH计测定POD-NLC混悬液PH为6.20±0.04,高效液相色谱法测定纳米粒中POD的平均包封率为82.9±2%。放置于4℃条件下,样本在6月内仍保持半透明、淡乳色、质地均匀及带淡蓝色乳光外观,未见分层、沉淀及药物结晶析出。放置于室温的样本,3个月内无絮状物、沉淀、分层出现;6个月时出现少量沉淀、分层,振荡后可恢复均一外观。样本均未出现霉菌斑。2.P0D-NLC在体外能显著抑制VK2/E6E7细胞的生长,其作用呈现浓度和时间依赖性。在相同处理时间条件下,细胞增殖抑制率随作用浓度的增加而升高。在特定浓度（0.05μg/ml,0.5μg/ml,5μg/ml）条件下,细胞增殖抑制率随作用时间的延长而升高。3.对POD酊剂和POD-NLC对细胞增殖抑制率进行比较,发现在0.0005μg/ml浓度时,POD酊剂和POD-NLC对细胞增殖影响较小且两者之间无显著差异（0.047±0.028%vs 0.068±0.023%,P＞0.05）;浓度为0.005μg/ml 时,POD 酊剂对细胞增殖抑制作用显著高于POD-NLC（0.332±0.116%vs 0.104±0.052%P＜0.05）;浓度为0.05μg/ml时,POD酊剂和POD-NLC对细胞增殖抑制作用无明显差异;浓度为0.5μg/ml时,POD-NLC对细胞抑制作用显著高于POD酊剂（0.813±0.095%vs 0.632±0.043%,P＜0.05）;当作用浓度升至5μg/ml 时,POD-NLC和POD酊剂对细胞抑制作用差异极其显著（0.993±0.002 vs 0.645±0.048,P＜0.01）。POD-NLC随着浓度的增加,对细胞增殖的抑制作用越来越强,浓度为5μg/ml时,对细胞增殖抑制率达99%;POD对细胞增殖的抑制作用在低浓度时随浓度的增加而增加,当浓度大于0.05μg/ml时,POD对细胞的抑制作用进入平台期,抑制率不再随浓度的增加而增大。浓度为5μg/ml POD酊剂对细胞的抑制作用随处理时间的延长（24h,48h,72h）没有统计学差异,POD对细胞增殖的最大抑制率为68.9%。而5μg/ml POD-NLC处理24h时,其对细胞增殖的抑制率已达98.4%,且在24-72h内持续维持98%以上的抑制率。4.0.05μg/mlPOD-NLC和POD分别处理VK2/E6E7细胞48h后,POD-NLC和POD处理组G2/M期细胞比例与对照组相比增加极其显著（86.3±8.5%vs 5.4±4.6%,p＜0.01;60.2±4.3%vs 5.4±4.6%,p＜0.01）,同时,POD-NLC和POD处理组之间也存在显著差异（86.3±8.5%vs 60.2±4.3%;p＜0.01）,POD-NLC对细胞周期抑制作用明显强于POD。5.POD和POD-NLC处理组细胞均呈现细胞膜皱缩,细胞脱落,染色质聚缩及碎块状细胞核等凋亡形态。用Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒对POD-NLC和POD处理48h后细胞凋亡进行检测,与对照组相比POD-NLC处理组细胞凋亡率升高了7.51%,POD处理组细胞凋亡率上升了9.48%。两个处理组之间凋亡率差别不大。结论1.低温固化一乳化蒸发法制备POD-NLC是可行的,POD-NLC的理化性质基本符合纳米药物载体的要求。2.POD-NLC对永生化人阴道上皮细胞增殖抑制作用呈现时间和浓度依赖性,POD-NLC和POD一样将细胞阻滞在G2/M期,并能诱导细胞产生凋亡。POD-NLC较POD对永生化人阴道上皮细胞具有更强的增殖抑制作用。