研究背景近几年来在工业化的世界里,虽然卫生条件正在逐步改善,但是遗传性过敏症和过敏性哮喘等疾病却有逐年上升的趋势。支气管哮喘是一种以气流可逆性受限和慢性气道炎症为特点的疾病,其发病机制复杂。目前,普遍认为2型辅助性T细胞/1型辅助性T细胞（Th1/Th2）失衡理论在哮喘发病机制中起主要作用,Th2功能增强、Th1功能抑制时可导致哮喘的发生。在哮喘患者肺泡灌洗液中可发现Th2相关细胞因子白介素13（IL-13）水平增高,研究发现其可通过激活嗜酸粒细胞,促进IgE分泌,参与支气管哮喘气道炎症的维持,诱导气道高反应性。但是,越来越多证据表明哮喘患者对过敏原存在免疫耐受机制缺陷也是导致Th1/Th2失衡的重要原因。新近研究表明:调节性T细胞（Treg）能够通过各种机制诱导机体对自身抗原和过敏原产生免疫耐受,尤其是CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞在哮喘的发病和治疗中的作用更为重要。在哮喘儿童外周血和诱导痰中发现TGF-β和CD4+Foxp3+Treg细胞水平较正常组明显降低;在患X相关自身免疫变态反应紊乱综合征的病人体内,因缺乏Treg基因的表达可出现因免疫炎症反应引起的严重皮疹、哮喘、食物过敏等。最近也发现预防接种卡介苗可通过增加CELA-4的表达,增加抗炎症细胞因子IL-10和TGF-β的表达,尤其引起相关CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞上调,来预防卵蛋白的气道致敏作用,从而减轻气道炎症。以上发现均提示上调Treg细胞可能具有防治哮喘的作用。CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞是CD4+T淋巴细胞的一个亚群。其中Foxp3被认为是Treg细胞的特异性细胞标志,能够对Treg细胞的发育和功能发挥关键的调节作用,其他的淋巴细胞如:CD4+CD25T细胞、B细胞和CD8+T细胞仅少量或无Foxp3的表达。与Treg细胞常见的表面标志（例如CD25、CD45RB、CTLA4和GITR）不同,Foxp3在T细胞活化过程中不会被上调,因此利用此特点能够将Treg细胞和其他活化的效应T细胞区别开来。髓源抑制性细胞（Myeloid-derived suppressor cells,MDSCs）主要由处于早期分化阶段的髓系细胞组成,该细胞群能够通过多种途径发挥免疫抑制功能。主要包括影响树突状细胞正常分化、抑制NK细胞的固有免疫应答反应或者直接抑制T细胞的增殖和杀伤能力等。近几年髓源抑制性细胞用于免疫治疗的研究被广泛报道,研究发现髓源抑制性细胞可过继转移至斑秃、炎症性肠病、移植物抗宿主病、自身免疫性脑脊髓炎、Ⅰ型糖尿病等动物模型中发挥免疫抑制功能,研究显示最终避免机体过度免疫应答所产生的病理损害,表明MDSCs用于细胞治疗具有独特的优势。Arora等研究也发现髓源抑制性细胞能够明显降低Th2相关因子IL-13水平,从而减轻小鼠气道炎症和气道高反应。Huang等的研究进一步证实髓源抑制性细胞可产生IL-10和TGF-β或者精氨酸酶（不依赖于TGF-β）,或上调荷瘤小鼠体内CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞水平而发挥免疫抑制作用。虽然越来越多的证据提示Tregs和MDSCs与肿瘤介导的免疫抑制有关,但MDSCs能否上调哮喘小鼠CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞,改善哮喘小鼠气道炎症,并进一步用于哮喘的治疗目前国内外报道较少。髓源抑制性细胞在小鼠中细胞表型通常为CD11b和Gr-1,也可因小鼠品系、疾病状态等仅表达CD11b或Gr-1。已有多项研究证实该细胞群在肿瘤免疫逃逸发挥的重要作用,但对于其他途径诱导的CD11b+Gr-1+细胞是否也属于具有免疫抑制功能的MDSCs亚群目前研究较少。有研究发现连续不断地暴露在脂多糖的条件下,可诱导表达CD11b、中量表达Gr-1和F4/80等细胞表面标志的髓源抑制性细胞的产生,这些分子表面标志能将他们与中性粒细胞、巨噬细胞、树突细胞相区别。这种细胞在过去的研究报道中已经被描述过,在Toll样受体（Toll-like Recept,TLR）激动剂例如脂多糖的存在下,造血干细胞和前体祖细胞能够在各种组织包括肺组织中衍生此类髓源性细胞。本实验通过从细胞表型分析、形态学和对T淋巴细胞抑制作用等方面试图证实脂多糖诱导的CD11b+Gr-1+髓系细胞群为具有免疫抑制功能的髓源抑制性细胞。我们假设:脂多糖诱导的MDSCs不仅能够抑制效应T细胞的增殖,而且能够诱导哮喘小鼠特异性Treg细胞进一步建立和维持T细胞耐受。实验进一步将体外分离提纯的MDSCs通过尾静脉注射的方式过继转移到哮喘小鼠,观察MDSCs对哮喘小鼠外周血CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞、Th2相关因子IL-13及气道炎症的影响,探讨MDSCs减轻哮喘小鼠气道炎症的可能机制。第一部分髓源抑制性细胞的诱导、分离及鉴定目的:磁珠分选脂多糖诱导的髓源抑制性细胞,并在体外进行鉴定。方法:SPF级BALB/c小鼠10只（雌雄不限）随机分为脂多糖组和正常对照组,分别予脂多糖或生理盐水腹腔注射以诱导MDSCs在脾脏中募集;采用CD11b免疫磁珠从脾脏组织中分选MDSCs,流式细胞术检测细胞表面特征分子表达情况,通过瑞氏-姬姆萨染色观察细胞形态,四唑盐比色法（MTT）测定MDSCs与T淋巴细胞在体外共培养后T细胞的增殖情况。结果:1.流式细胞术检测MDSCs的细胞表型:脂多糖组小鼠脾脏组织中CD11b+Gr-1+MDSCs 比例为（28.35±8.57）%,较正常对照组（6.25±2.73）%增多,差别有统计学意义（t=5.489,P=0.003）;采用CD11b免疫磁珠可从注射脂多糖的小鼠脾脏中分离出纯度高达88.82%的CD11b+Gr-1+MDSCs;2.MDSCs的形态学观察:脂多糖诱导MDSCs经过瑞氏-姬姆萨染色后呈现出伴有环状或分叶状细胞核的圆形细胞;3.MDSCs对脾脏T细胞增殖的抑制作用:MTT检测提示在MDSCs共培养条件下,ConA刺激的T细胞增殖受到抑制。与对照组相比,所有MDSCs组A值降低,且此作用与MDSCs的数量成正相关（F=52.211,P=0.000）。以上结果均提示脂多糖诱导的MDSCs能抑制T淋巴细胞增殖,且具有剂量依赖性。结论:1.脂多糖可在短期内诱导大量MDSCs在小鼠脾脏中聚集;2.CD11b免疫磁珠可分离较高纯度的脂多糖来源MDSCs;脂多糖诱导的CD11b+Gr1+髓系细胞群为实验中多次报导的具有免疫抑制功能的髓源抑制性细胞。第二部分脂多糖诱导髓源抑制性细胞对哮喘小鼠CD4+调节性T细胞及气道炎症影响目的:观察脂多糖来源的CD11b+Gr-1+髓源抑制性细胞移植对支气管哮喘小鼠气道炎症的影响,探讨MDSCs上调CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞（Treg）及抑制过度Th2应答在改善哮喘小鼠气道炎症中的作用。方法:雌性BALB/c小鼠34只,其中4只接受脂多糖腹腔注射,用于制备髓源抑制性细胞,方法同第一部分;另外30只小鼠随机分为正常对照组、哮喘组和细胞治疗组。哮喘组和细胞治疗组给予卵白蛋白溶液致敏后反复雾化吸入卵白蛋白溶液进行激发建立哮喘模型。正常对照组以生理盐水代替卵白蛋白溶液,细胞治疗组在诱导哮喘第14天、21天尾静脉分别注入体外磁珠分离的脂多糖诱导的髓源抑制性细胞。各组在末次激发24 h内计数支气管肺泡灌洗液中细胞总数并分类,结合病理切片分析气道炎症情况;采用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测支气管肺泡灌洗液和血清中Th2相关细胞因子IL-13的变化;流式细胞仪检测外周血CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞的比例。结果:1.致敏和激发过程小鼠的行为学改变:哮喘组小鼠出现立毛、前肢搔鼻,烦躁不安,然后俯伏不动、呼吸急促、二便失禁等症状,而正常组小鼠无此阳性症状;2.哮喘模型建立成功判定:哮喘模型组小鼠行为学的表现、白细胞分类计数结果及肺脏病理检查结果均符合哮喘小鼠模型的判定标准;3.支气管肺泡灌洗液（BALF）细胞计数结果:与正常对照组比较,哮喘组支气管肺泡灌洗液细胞总数、嗜酸粒细胞和中性粒细胞百分比增高（P=0.000,P=0.000,P=0.020）;与哮喘组对比,细胞治疗组细胞总数、嗜酸粒细胞和中性粒细胞比例均降低,差别有统计学意义（P=0.002,P=0.000,P=0.033）;4.肺组织病理学改变:正常对照组小鼠肺组织结构较清晰,基本无炎症细胞浸润;哮喘组小鼠细支气管和血管周围发现大量炎症细胞浸润,气道上皮损伤,结构紊乱,气道内杯状细胞肥大增生,粘液分泌增加;与哮喘组相比,细胞治疗组支气管及血管周围炎症减轻;5.小鼠血清和BALF中IL-13含量:与对照组相比,哮喘组小鼠血清和BALF中的IL-13水平上升有显著性意义（P=0.000,P=0.000）;而细胞治疗组较哮喘组IL-13含量下降,差别有统计学意义（P=0.000,P=0.000）;6.小鼠外周血Treg细胞流式分析:哮喘组小鼠外周血CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞占CD4+T细胞比例较正常组降低,在细胞治疗组该比例较哮喘组升高,差别均有统计学意义（F=17.682,P=0.000）。结论:过继转移来源于脂多糖诱导的CD11b+Gr-1+髓源抑制性细胞,能通过上调哮喘小鼠外周血CD4+CD25+Foxp3+Treg 比例,降低血清和BALF IL-13水平,对哮喘小鼠气道炎症具有抑制作用,这可能是其抑制哮喘小鼠气道炎症的机制之一,MDSCs对哮喘小鼠气道炎症的影响可能存在其他重要机制。因此,探讨适宜的策略诱导CD11b+Gr-1+髓源抑制性细胞的募集以及免疫抑制功能的增强,可望成为临床过敏性哮喘预防和治疗的一种新策略。