论文部分内容阅读
目的: 自身免疫性肝炎(AIH)是一种免疫介导的慢性肝脏炎症性疾病，以血清转氨酶和免疫球蛋白G(IgG)升高，自身抗体阳性，界面性肝炎为特征。研究发现它与环境诱发、免疫耐受打破、遗传易感性等有关，这些因素共同诱导产生针对肝脏抗原的T细胞介导的免疫侵害作用。其发病隐秘，通常以非特异性症状起病，严重病例可快速进展为肝硬化和肝衰竭。单独皮质类固醇或者低剂量与硫唑嘌呤结合治疗改善大部分病人的症状及肝脏炎症的实验室和组织学表现。然而该治疗不一定都有效，且其药物依赖性及副作用严重影响病人生活质量。 间充质干细胞(MSCs)是多向成体干细胞，具有自我更新和多向分化潜能。MSCs能修复组织损伤、抑制免疫细胞活化和增殖、调节免疫应答。MSCs作为免疫调节剂用于治疗已在器官移植、阻止移植物抗宿主病和自身免疫性疾病如炎症性肠病、系统性红斑狼疮、多发性硬化等方面进行探索。然而MSCs对自身免疫性肝炎的疗效问题研究的较少。 在先前的研究中，发现同种异体骨髓间充质干细胞移植对小鼠自身免疫性肝炎具有治疗作用，现在重点讨论多次干细胞移植的疗效，并通过观察自身免疫性肝炎小鼠模型中及骨髓间充质干细胞移植干预后程序性死亡配体1(PD-L1)和白介素17(IL-17)的表达情况来探讨其可能的机制。 方法: 健康雄性C57BL/6小鼠，10-12周龄，在第0天和第7天腹腔注射同系小鼠肝脏匀浆S-100与弗氏完全佐剂的乳化液，第21天血生化检测和肝脏组织病理学观察鉴定模型是否成功。 取出冻存的骨髓间质干细胞，复苏培养后，用0.25％胰蛋白酶消化，之后使细胞悬浮于生理盐水中，调整细胞密度至1×106个/ml，准备用于小鼠尾静脉移植。对照组6只小鼠。造模小鼠随机分为模型组和MSCs移植组。移植组再按照移植次数分为一次、二次、三次三个亚组。对照组小鼠在第0天和第7天腹腔注射1.0ml生理盐水。模型组小鼠在第21天尾静脉注射0.1ml生理盐水。MSCs移植一次组在第21天尾静脉注射1×105个MSCs;移植二次组在第21天和第28天分别尾静脉注射1×105个MSCs;移植三次组在第21天、28天和35天尾静脉注射1×105个MSCs（0.1ml/只）。所有小鼠均在第42天处死，并收集肝脏组织和血清。采用HE和Manson染色观察肝组织病理变化，根据Ishark等级评分系统评估肝脏纤维化和坏死炎症活动指数。血清检测ALT和AST水平;采用RT-PCR检测各组肝脏PD-L1和IL-17mRNA水平，Western印迹法检测各组肝脏PD-L1蛋白表达情况，ELISA检测肝脏IL-17表达情况。应用SPSS19.0对各组数据进行统计学分析比较，P＜0.05提示差异具有统计学意义。 结果: 1、成功建立小鼠自身免疫性肝炎模型模型组小鼠血清ALT、AST（ALT和AST分别为97.33±14.39U/L和474.83±31.67U/L）较对照组(62.33±13.589U/L和176.17±19.104U/L)明显升高;MSCs移植组较模型组下降，并随治疗次数逐步下降（移植三次组ALT和AST分别为48±11.225U/L和200.5±23.914U/L。HE染色镜下观察示:对照组肝小叶结构完整，肝细胞呈放射状排列在小叶中央静脉周围，汇管区无炎性细胞浸润;模型组小叶中央和汇管区可见炎症细胞浸润，同时可见小叶内的炎症损伤和坏死;MSCs移植组组织损伤和炎症细胞浸润明显改善，特别是移植三次组，损伤明显减轻，仅可见少量炎症细胞浸润。 2、肝组织中PD-L1表达情况模型组PD-L1mRNA水平较对照组明显增高(PD-L1/β-actin吸光度比值为1.601±0.161vs.0.930±0.145，P＜0.05)，MSCs移植一次组较模型组下降，但随着移植次数增加，其表达逐渐增加，移植三次组较移植一次组显著增加(1.809±0.167vs.1.195±0.069)。同样的，Western blot结果显示模型组表达增多的PD-L1蛋白在MSCs移植组被逆转，随着移植次数增多，其表达增加，移植一次组与三次组比较有统计学意义(PD-L1/GAPDH0.633±0.066vs.0.802±0.066, P＜0.05)。 3、肝组织中IL-17表达情况ELISA结果示与对照组相比，IL-17蛋白表达在模型组增高(219.529±33.432 vs.92.313±18.600，P＜0.05)，MSCs移植干预后，其表达下降，并且随着移植次数增多，其表达逐渐减低(182.490±34.645，127.743±19.735，94.126±16.923)，这与PD-L1表达趋势相反，表明MSCs可能有通过促进PD-L1的表达抑制IL-17的产生。IL-17mRNA表达情况与蛋白相似。 结论: MSCs能改善小鼠自身免疫性肝炎，并且多次治疗的疗效更佳;在模型组中，PD-L1及IL-17表达水平升高，提示PD-L1及IL-17的表达可能参与自身免疫性肝炎的发生发展;MSCS多次移植干预后，肝脏炎症浸润明显减轻，PD-L1水平逐渐增加，而IL-17表达逐渐下降，提示MSCs治疗作用可能部分通过PD-L1途径抑制Th17细胞分泌IL-17，减轻细胞免疫介导的炎症损伤，从而起到负向免疫调节作用。