基于DNA组装体的纳米结构的构筑及其应用

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滚环扩增技术是一种可用于DNA自组装的新兴纳米技术,近些年来发展迅速。该技术以可设计的环状DNA为模板,在引物、四种三磷酸核苷及DNA聚合酶的共同作用下生成具有多个重复序列的单链DNA,此技术可以实现信号放大的目的,能提高检测灵敏度。DNA自组装已经是公认的强大的纳米结构的构建方法,这种方法包括DNA折纸术、DNA模块组装等。然而因序列设计的复杂性,以及对纳米尺度拓展的有限性,一定程度上限制了自身的发展。核酸适配体是能与特定靶标结合的小分子DNA或RNA,具有高亲和性和高特异性,被广泛用于蛋白的分析检测、肿瘤的早期诊断以及靶向给药。分子信标(molecular beacon,MB)是一种新型的呈发卡结构的荧光探针,因其操作简便,噪音低,灵敏度高,被用于RNA、氨基酸、蛋白质以及肿瘤标志物的检测,应用前景广阔。本论文将滚环扩增技术与DNA自组装相互结合,解决了单纯DNA自组装所体现的局限性;同时论文中将DNA自组装技术与分子信标相结合,将AS1411适配体修饰在分子信标上,构建了可以靶向检测的具有信号放大作用的聚分子信标:(1)利用滚环扩增技术合成的长链大分子产物结合短链DNA构筑了DNA纳米结构。通过改变离子浓度,RCA产物与短链浓度比,来探究DNA纳米结构的组装情况,利用琼脂糖凝胶电泳、透射电镜和原子力显微镜进行表征,得到了组装DNA纳米结构的最适条件。(2)设计了含有适配体序列的修饰FAM基团的短链以及普通序列修饰FAM基团的短链,通过不同方式(包括凝血酶、互补短链等)将包埋在卷曲短链里的荧光释放;通过修饰Dabcyl猝灭基团的短链将DNA纳米结构荧光猝灭之后,加入互补链将修饰有猝灭基团的短链替换下来,实现DNA纳米结构的荧光恢复。通过荧光光谱仪以及荧光显微镜表征了DNA纳米组装体荧光的触发与调控。设计了一种新型的具有83个碱基的的分子信标,此分子信标上修饰了能靶向识别癌细胞的AS1411适配体,通过与RCA技术相结合,构建含适配体的聚分子信标。该新型分子信标与一般分子信标相比,显著提高了目标物的灵敏度,并且具有精确的靶向识别能力,可以实现肿瘤早期症状的敏锐诊断。通过荧光分光光度计、荧光显微镜以及酶标仪等手段,探究了该分子信标达到理论最佳效果时所需的最佳实验条件,以及该体系靶向识别B16肿瘤细胞的能力。
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