17β-雌二醇对人成骨肉瘤MG-63细胞和成人成骨细胞CTGF和PAIP-1mRNA表达的作用绝经后骨质疏松症((postmenopausalosteoporosis，PMOP)已成为严重威胁老年妇女身体健康的常见疾病，雌激素缺乏是其根本病因，但具体发病机制尚未阐明。为进一步探讨PMOP的发病机制和雌激素的作用机制，早期筛查骨质疏松的易感人群，分离和鉴定雌激素相关基因显得非常重要。至今尚未见雌激素诱导成骨细胞基因表达谱变化的系列研究报道。我们首次选择具有成人成骨细胞表型特征的人成骨肉瘤MG-63细胞作为细胞模型，17β雌二醇(17β-estradiol，E2)干预后，采用cDNA代表性差异分析法(cDNArepresentationaldifferenceanalysis，cDNARDA)联合cDNA阵列点杂交筛查雌激素相关基因表达谱。研究显示，受雌激素诱导表达上调的基因与能量供应、类固醇类激素代谢、基因转录与翻译调控、炎症反应和肿瘤发生等相关，受雌激素诱导表达下调的基因与骨基质形成、转录信号转导及细胞分化发育调节等相关。其中，结缔组织生长因子(connectivetissuegrowthfactor，CTGF)受雌激素诱导后表达下调，多聚腺苷酸结合蛋白相互作用蛋白-1(polyadenylate-bindingproteininteractingprotein1，PAIP-1)受雌激素诱导后表达上调。 CTGF是一个高度保守的肽类家族——CCN家族中的成员，参与了体内的多种生理和病理过程，尤其在TGF-β依赖性的纤维化途径中发挥重要作用。在生理状态下，CTGF可调节细胞外基质的形成以及蛋白水解酶和蛋白酶抑制剂的合成。PAIP-1可通过促进PABP介导的翻译过程，从而在翻译水平上的基因表达调控方面发挥重要作用。但目前尚不明了CTGF、PAIP-1是否参与了雌激素介导的骨代谢调控作用。为进一步探讨CTGF和PAIP-1在成骨细胞的表达情况以及是否受雌激素的调控，我们采用半定量RT-PCR和Northernbloting方法观察这些基因在人成骨肉瘤MG-63细胞和成人成骨细胞的表达变化，以及E2干预后对其表达水平的影响。 本研究的发现和结论：(1)人成骨肉瘤MG-63细胞和体外培养成人成骨细胞增殖分化不同阶段均表达CTGF和PAIP-1mRNA。(2)17β-E2可剂量依赖性下调1人成骨肉瘤MG-63细胞和成人成骨细胞CTGFmRNA的表达，而且，在成骨细胞这种下调作用具有明显的时间依赖性，于12～24h下调作用最明显。(3)E2下调人成骨肉瘤MG-63和成骨细胞CTGFmRNA的表达的作用不是通过经典的核受体途径介导的，这为我们进一步研究雌激素对CTGF调控的信号转导机制以及CTGF在骨代谢中作用，提供了新的思路和理论基础。 Wnt诱导分泌蛋白(Wnt-induciblesecretedproteins,WISP3)也是CCN家族中的成员之一，与晚发型脊柱骨骺发育不良伴进行性骨关节病(spondyloepiphysealsdysplasiatardawithprogressivearthropathy，SEDT-PA)的发病密切相关。SEDT-PA，又称为儿童进行性假类风湿性关节病或进行性假类风湿性骨发育不良，是一种主要累及软骨组织的常染色体隐性遗传性疾病。1983年由Spranger等首先报道，临床上甚为罕见。我们收集到一个SEDT-PA家系，对其可能致病基因进行了序列筛查。研究发现，两名患者的WISP3基因外显子8出现复合杂合性基因突变，一条来自父方，在WISP3第334位密码子首位碱基出现T到C的错义突变(1000T→C)；另一条来自母方，在WISP3第280位密码子的末位碱基出现缺失突变(840delT)。这表明中国人的SEDT-PA发病与WISP3基因突变密切相关。 第一部分雌二醇诱导人成骨样MG-63细胞差异表达基因的分离和鉴定 目的筛查E2诱导人成骨肉瘤MG-63细胞株差异表达cDNA片段，寻找人成骨肉瘤MG-63细胞中雌激素相关基因。 方法改良的cDNA代表性差异分析法分离E2干预人成骨肉瘤MG-63细胞株表达上调和下调的cDNA片段。Southern杂交证实其来源后，制备阵列膜行斑点杂交，然后挑取阳性差异表达cDNA克隆测序并行同源比较分析。结果(1)经过4轮消减杂交和动力性富集后分别得到3个E2诱导人成骨肉瘤MG-63细胞表达上调的cDNA条带和2个E2诱导人成骨肉瘤MG-63细胞表达下调的cDNA条带；(2)点杂交筛查得到120个差异表达阳性cDNA克隆，分别选20个表达上调和20个表达下调克隆测序，共得到36个序列，其中表达上调者有17个序列，表达下调者19个序列。17个表达上调序列分别代表13个不同的基因，其中8个与己知基因同源，5个序列未比到同源序列，可能为新基因；19个表达下调序列分别代表14个不同基因，均与已知基因高度同源。结论cDNA代表性差异分析法能有效筛查差异表达cDNA片段，联合cDNA阵列点杂交方法可快速高通量筛查差异表达基因。E2诱导人成骨肉瘤MG-63细胞中与骨基质组成、能量供应、类固醇类激素代谢、基因转录、炎症反应和肿瘤发生等相关基因差别表达，可能从分子水平提供一些关于雌激素在绝经后骨质疏松症发病中所起保护作用的新依据。 第二部分人成骨肉瘤MG-63细胞和成人成骨细胞CTGF和PAIP-1mRNA的表达目的观察人成骨肉瘤MG-63细胞和成人成骨细胞CTGF和PAIP-1mRNA的表达。 方法VanGieson法1型胶原染色，0.1％茜素红矿化结节染色；半定量RT-PCR检测人成骨肉瘤MG-63细胞和成人成骨细胞碱性磷酸酶(alkalinephosphatase，ALP)、骨钙素(boneglaprotein，BGP)和1型胶原mRNA的表达以及CTGF和PAIP-1mRNA的表达。 结果确定人成骨肉瘤MG-63细胞和体外培养成人成骨细胞增殖分化的三个阶段，即细胞增殖阶段(MG-63细胞：0～9d，成骨细胞：0～11d)、基质成熟阶段(MG-63细胞：7～18d，成骨细胞：7～15d)和骨基质矿化阶段(MG-63细胞：17～18d后，成骨细胞：15d后)；人成骨肉瘤MG-63细胞和成人成骨细胞均检测到CTGF和PAIP-1mRNA的表达。 结论不同增殖分化阶段的人成骨肉瘤MG-63细胞和成人成骨细胞均检测到CTGF和PAIP-1mRNA的表达。 第三部分17β-雌二醇对人成骨肉瘤MG-63细胞和成人成骨细胞CTGF和PAIP-1mRNA表达的作用目的观察E2对人成骨肉瘤MG-63细胞和成人成骨细胞CTGF和PAIP-1mRNA表达的影响。 方法用半定量RT-PCR和Northernbloting方法检测在不同剂量和不同时间下E2对人成骨肉瘤MG-63细胞和成人成骨细胞CTGF和PAIP-1mRNA表达的影响。 结果10-8和10-6E2均明显下调人成骨肉瘤MG-63细胞CTGFmRNA的表达，10-100E2对人成骨肉瘤MG-63细胞CTGFmRNA下调作用不明显，无时间依赖关系；10-10、10-8和10-6E2均明显下调成人成骨细胞CTGFmRNA的表达，呈时间依赖关系，以10-8E2作用12～24下调作用最明显。E2对人成骨肉瘤MG-63细胞和成人成骨细胞PAIP-1mRNA的表达无明显影响。 结论E2可下调人成骨肉瘤MG-63细胞和成人成骨细胞CTGFmRNA的表达，且呈时间、剂量依赖性下调成人成骨细胞CTGFmRNA的表达；但对PAIP-1mRNA的表达无明确作用。 第四部分晚发型脊柱骨骺发育不良伴进行性骨关节病患者致病突变基因的筛查目的WISP3也是CCN家族中的成员之一，与SEDT-PA的发病密切相关。我们收集到一个SEDT-PA家系，对其分子病因进行探讨。 方法采用PCR扩增SEDT-PA可能的致病候选基因WISP3(CCN6)1～8外显子以及Ⅲ、Ⅹ、Ⅺ型胶原基因的部分外显子，ABIPRISMBigDyeTerminator循环测序试剂盒及ABIPRISMTM377XL自动DNA测序仪进行测序，以确定基因突变位点；采用PCR-RFLP技术对其家系和正常人群进行基因突变频率的检测。 结果两名患者的WISP3基因外显子8出现复合杂合性基因突变，一个来自父方，在WISP3第334位密码子首位碱基出现T到C的错义突变(1000T→C)，并在其家系其他4个成员中发现该突变位点的携带者；另一个来自母方，在WISP3第280位密码子的末位碱基出现缺失突变(840delT)，其母亲为该突变位点的携带者，但在家系其他成员中未发现该突变位点的携带者。在正常人群中未检测到上述两种突变。 结论WISP3基因复合杂合性突变引起常染色体隐性遗传性SEDT-PA。