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急性胰腺炎(Acute Pancreatitis,AP)易并发多脏器功能衰竭,而危及患者的生命,其发病机理并不十分清楚,长期以来认为AP是一种炎症反应所致的胰腺腺泡细胞损伤、间质水肿和出血,并且可以导致局部和全身并发症。
氧化应激是在机体内活性氧生成和抗氧化物质失衡状态下,直接或间接通过信号转导通路引起细胞的损伤,在AP的发病中发挥重要作用,并与胰腺炎时胰腺外器官的损伤有密切的联系。在AP的过程中,过氧化氢酶(catalase,CAT)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)的活力下降,丙二醛(malondialdehyde,MDA)的含量升高。并且在炎症应答过程中,致炎因子和氧化应激发挥协同作用,肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosis:factor alpha,TNF-α)是AP早期转录水平增加较早的细胞因子,能促进炎症部位白细胞聚集和活化,活化的白细胞又可产生大量氧自由基(oxygen freeradicals,OFRs)。细胞间粘附分子-1(intercellular adhesionmolectlle-1,ICAM-1)诱导白细胞的聚集,在AP和AP相关肺损伤中起着重要的作用。诱生型环氧化酶-2(induciblecyclooxygenase enzyme-2,COX-2)是炎症过程中一个诱导酶,COX-2的表达也是诱导内皮细胞表达粘附分子的早期事件,和粘附因子的表达有直接关系。这些细胞因子受到外部刺激或损伤时产生,构成了一个复杂的网络,作用于胰腺,并导致了炎症反应的级联扩增,从而影响了AP的病程和预后。在AP,氧化应激损害是OFRs产生增加和抗氧化能力减弱的结果,抗氧化剂可减少OFRs产生或直接清除机体产生的OFRs,保护组织抗氧化物酶的活性,增强机体的抗氧化能力。α-硫辛酸(α-Lipoic acid,ALA)具备一般抗氧化剂所不能及的抗氧化性,近年来在抗氧化、糖代谢、糖尿病并发症和其他多种疾病治疗方面的重要作用受到国际生物医学界的高度关注。最近Park SJ等研究显示ALA能够对胆囊收缩素八肽(cholecystokinin-8,CCK-8)所诱导的急性胰腺炎大鼠具有保护作用,能够明显减轻胰腺重量/体重及血清脂肪酶和淀粉酶水平。由此,探讨抗氧化剂ALA的对AP的治疗作用具有较好的应用价值。
目的:
本研究通过建立AP模型,并施与ALA干预,观察SOD、MDA、。ICAM-1、TNF-α及COX-2的表达情况,探讨其在AP炎症反应中的作用,探讨ALA对实验性AP的治疗作用及机制。
方法:
1、动物模型的制备:选取wistar雄性大鼠,以10%水合氯醛腹腔注射麻醉,取上腹正中作切口进入腹腔,用4号加工钝头头皮静脉针于十二指肠乳头附近逆行插入胰胆管,以0.2ml/min速度注入3.5%牛磺胆酸钠(0.1ml/100g),推药后用无创血管夹夹住胰胆管入十二指肠处,观察10min,去除血管夹,关腹。
2、实验分组:将雄性wistar大鼠120只,随机分为假手术组(SO group,n=30)、AP模型组(AP group,n=30)、AP+生理盐水对照组(AP+NS group,n=30)、AP+α-硫辛酸治疗组(AP+ALA group,n=30),后又以不同时间点1h、3h、6h、9h、12h分为五个亚组,每个亚组为6只大鼠。其中AP+NS组于造模后不同时间点腹腔腹腔内注射生理盐水5ml/mg;AP+ALA组于造模后不同时间点腹腔腹腔内注射ALA1mg/kg。
3、生化指标测定:取血清样本,采用全自动血清生化分析仪检测血清淀粉酶,由河北医科大学第二医院生化室协助测定。
4、胰腺组织学检查:采用石蜡切片,HE染色。
5、SOD活力及MDA含量测定:取胰腺组织制成组织匀浆,用化学比色法测定,具体操作按南京建成生物工程研究所提供的测试盒说明书进行。
6、细胞因子测定:采用ELISA测试盒测定血清中细胞因子TNF-α及ICAM-1,具体操作按上海森雄生物有限公司所提供的测试盒说明书进行。
7 COX-2免疫组织化学染色:脱蜡至水,抗原热修复后,用3%过氧化氢孵育15min。封闭一抗4℃过夜,阴性对照用PBS代替一抗。先后滴加二抗、三抗各17min,后用3,3-二氨基苯联胺(DAB)显色,复染后封片。以细胞浆内呈现黄褐色颗粒为阳性表达。
结果:
1、大鼠胰腺的病理学变化:肉眼和光镜所见SO组胰腺及周围组织结构始终大致正常;AP+NS组和AP组随着时间的推移,胰腺及周围组织水肿、出血和坏死面积逐渐扩大,程度逐渐加重,腹水也增多;而AP+ALA组较AP+NS组和AP组的组织结构破坏相对较轻。
2、血清淀粉酶的变化:在各时间点,SO组无明显变化,AP组、AP+NS组及AP+ALA组与SO组比较均显著升高(P<0.05),AP+ALA组较AP组及AP+NS组显著降低(P<0.05)。
3、SOD活力的变化:SO组SOD活力在各时间点无明显差异,与SO组相比,AP+ALA组SOD活力在6h、9h点明显升高,在1h、3h、12h点则无显著性差异(P>0.05)。AP组、AP+NS组与AP+ALA组相比,在3h、6h、9h和12h点SOD活力明显下降(P<0.01)。
4、MDA含量的变化:SO组MDA在各时间点无明显变化,与SO组相比,AP组及AP+NS组,各个时间点MDA均显著升高(P<0.05),AP+ALA组MDA值在1h、3h点无显著性差异(P>0.05),6h、9h、12h点明显升高。与AP+ALA组相比,AP组、AP+NS组MDA在各时间点均明显升高(P<0.05)。
5、血清TNF-α的变化:在各时间点,SO组无明显变化,AP组、AP+NS组及AP+ALA组与SO组比较均显著升高(P<0.01),于6h点达高峰,之后略下降。较AP组及AP+NS组相比,AP+ALA组降低(P<0.05)。
6、血清ICAM-1的变化:在各时间点,SO组无明显变化,AP组、AP+NS组及AP+ALA组与SO组比较均显著升高(P<0.01),在1h、3h、6h、9h和12h点呈逐渐上升的趋势。AP+ALA组较AP组及AP+NS组比较降低(P<0.05)。
7、COX-2在胰腺组织中的表达:SO组胰腺组织中COX-2几乎没有表达。AP组及AP+NS组,胰腺腺泡细胞、导管细胞、胰岛细胞有较强的表达,呈棕黄色颗粒。AP+ALA组在胰腺腺泡细胞、导管细胞、胰岛细胞表达减弱,呈弱阳性。
结论:
1、逆行胆胰管内注射3.5%牛磺胆酸钠,通过胰腺组织HE染色观察到胰腺及周围组织水肿、出血和坏死等表现,检测血清淀粉酶升高,证实大鼠AP模型制备成功。
2、在AP大鼠胰腺组织中,SOD活力降低、MDA含量升高,表明氧化应激在AP的发病机制中起重要作用。
3、ALA是强有力的抗氧化剂,能够改善胰腺水肿、出血和坏死的病理学变化,降低血清淀粉酶活性,增加胰腺组织SOD活力,降低MDA含量,认为ALA对大鼠AP起到有效的治疗作用。
4、ALA对AP大鼠抗氧化作用机制可能与抑制细胞因子TNF-α、ICAM-1活性,以及抑制COX-2表达有关。