研究背景及目的：　　肝细胞癌（Hepatocellular carcinoma, HCC）是全球范围内最为常见的恶性肿瘤之一且预后不良。肿瘤的快速增殖、耐药、复发和转移是阻碍肝癌治愈的主要原因，但内在的肿瘤发生机制并未得到全面解释；研究证实肝癌的发生发展是由一系列基因的累积性改变所导致的。因此，针对肿瘤相关基因网络的异常改变进行深入研究，将有助于发掘重要的分子靶点，进而开展针对肿瘤特异性生物分子（基因和/或蛋白）的高效靶向治疗。Hedgehog（Hh）信号通路的异常激活在肿瘤恶性增殖中起重要作用。已有的研究发现Hh通路的主要组分（Shh、Ptch1、SMO、Gli1及Gli2）在肝癌细胞中异常活化，而抑制其效应转录因子Gli2的表达能显著削弱体外培养肝癌细胞的增殖能力。但是 Gli2影响肝癌增殖的具体分子机制还待进一步明晰。肿瘤细胞的增殖与细胞有丝分裂有关，有丝分裂相关驱动蛋白(Kinesins)在肿瘤细胞有丝分裂过程中具有重要作用。Hh-Gli2通路对肿瘤增殖的促进作用是否通过调控并依赖有丝分裂相关驱动蛋白基因的表达来实现是本项研究的论证重点，研究从生物信息学、分子、细胞生物学以及临床队列等多层次进行探索和验证，试图阐明有丝分裂相关驱动蛋白 KIF20A受Hh-Gli2调控的分子机制，并证明Gli2-KIF20A信号轴在调控肝癌细胞恶性增殖过程中的重要作用及靶点价值。本研究的开展有助于明晰肝癌细胞恶性增殖的分子机制，为未来应用于肝细胞癌的靶向治疗提供新的理论依据。　　方法：　　第一部分：KIF20A是Hedgehog信号通路的下游靶基因　　1、Hh信号通路在调控细胞周期及细胞增殖过程中起重要作用，为研究抑制Hh信号通路后肝细胞癌基因表达谱的变化，首先利用real-time PCR和Westernblot筛选出Gli2高表达的肝癌细胞系，并分别使用cyclopamine(SMO抑制剂)及GANT61(Gli1/2抑制剂)分别抑制Hh通路的上下游信号。通过Microarray技术寻找受Hh通路抑制影响的靶基因簇　　2、在NCBI GEO数据库中检索已公开的肝癌表达谱芯片数据集，进行差异表达基因的大范围meta分析，通过两种meta分析的方法确定在肝癌组织中显著高表达的基因。再将meta结果与受Cyclpamine及GANT61抑制的基因列表进行交集以确定在肝癌中异常高表达且受 Hh通路调控的基因，并通过 real-time PCR技术验证。　　3、为进一步研究是否 KIF20A受 Shh-Gli2通路的调控。在 Gli2高表达的HCC-LM3及 MHCC-97H细胞中干扰 Gli2的表达或利用 Hh通路抑制剂（Cyclpamine及GANT61）处理，之后利用Western bolt检测KIF20A的蛋白表达情况。在另外两株Gli2相对低表达的HepG2及Huh7细胞中转染Gli2表达质粒或使用N-shh处理后利用Western bolt检测KIF20A的表达。为明确N-Shh是否通过Gli2调控KIF20A的表达，在N-shh存在的培养条件下抑制HepG2中Gli2的表达，之后利用Western bolt检测KIF20A蛋白水平变化。　　第二部分：转录因子Gli2通过活化FoxM1调控KIF20A的表达　　1、为进一步研究Gli2是否通过激活KIF20A的启动子区来调控KIF20A的表达。我们构建了偶联荧光素报告基因的KIF20A启动子区。利用Dual-luciferase检测增加或抑制Gli2表达后，KIF20A启动子区偶联荧光素信号的变化。　　2、为确定Gli2是否通过与KIF20A启动子区直接相互作用调控KIF20A的表达，通过生物信息学预测 Gli2在KIF20A启动子区的潜在结合位点，并利用染色质免疫共沉淀法（ChIP）检测这些结合位点的有效性。　　3、对 ChIP验证的含有潜在转录因子结合位点的启动子区（ FoxM1或KIF20A）进行分段克隆，利用Dual-luciferase分析以确定ChIP所验证的启动子区结合位点是否具有功能。　　第三部分：Gli2-KIF20A信号轴调控肝癌细胞的增殖及细胞周期进程　　1、为研究KIF20A在肝癌细胞中所起的生物学作用，利用miRNAi-KIF20A干扰质粒抑制HepG2及HCC-LM3细胞中KIF20A的表达，并通过细胞增殖相关实验评价KIF20A对肝癌细胞增殖的影响。　　2、为研究抑制KIF20A表达影响肝癌细胞增殖的机制，采用流式细胞分析检测KIF20A表达抑制后细胞周期分布的变化。为确定KIF20A干扰后对HepG2细胞胞质分裂的影响，利用共聚焦实时活细胞拍摄技术及荧光显微技术做进一步分析。　　3、为验证Gli2促进肝癌细胞周期进程是否需要依赖下游KIF20A的表达，在Gli2过表达的肝癌细胞中，利用miRNAi干扰KIF20A的表达并通过克隆形成、流式细胞学实验分析肝癌细胞增殖能力的变化。　　4、为进一步明确Gli2-KIF20A信号轴在肝癌细胞增殖中的重要性，利用慢病毒转染技术建立了三株分别稳定表达（shRNA-control，shRNA-Gli2， shRNA-KIF20A）的HCC-LM3细胞，并建立肿瘤裸鼠皮下移植瘤模型。观察移植瘤在体内的增殖情况。　　第四部分：Gli2、FoxM1及KIF20A在肝癌组织中异常活化并显著影响临床预后　　1、为验证体外及体内研究的结果，我们通过免疫组化技术检测了Gli2, FoxM1及KIF20A在临床肝癌样本及其对应非癌组织中的表达情况。使用“德国半定量”评分法对表达量进行评分。同时，通过Western blot在随机选取的冰冻样本中验证免疫组化分析结果。　　2、利用Spearman秩相关系数检验分析了Gli2、FoxM1和KIF20A三种基因在肝癌中表达的相关性。并采用卡方检验或fisher确切概率卡方检验分析Gli2, FoxM1, KIF20A与临床病理特征间的相关性。　　3、为研究Gli2、FoxM1、KIF20A的表达对肝癌患者生存预后的影响，利用Kaplan-Meier生存曲线分别分析了三个基因的高低表达对患者总生存（OS）及无病生存（DFS）期的影响，并与其他因素同时纳入多因素COX比例风险回归模型确定能显著影响患者预后的独立风险因素。　　结果：　　第一部分：KIF20A是Hedgehog信号通路的下游靶基因　　1、转录因子Gli2在HCC-LM3及MHCC-97H细胞中相对高表达，在HepG2中相对低表达，在 Bel-7402, Huh7及 SK-Hep1细胞呈中等表达水平。利用cyclopamine及GANT61抑制Hh信号通路后，寡核苷酸表达谱芯片分析发现有335个基因的表达出现共同下调(DiffScore<-50)。　　2、依据入组标准共纳入6项公开发表的肝癌表达谱芯片数据集进行 meta分析，meta分析确定175个基因在肝癌组织中显著高表达。将Microarray分析发现的335受cyclopamine及GANT61抑制的基因与meta分析的175个基因进行交集，发现7个Hh潜在靶基因在肝癌细胞中异常活化，其中KIF20A属于驱动蛋白家族，其与细胞的有丝分裂及增殖密切相关。　　3、经 cyclopamine, GANT61处理或转染 Gli2-shRNA后，HCC-LM3及MHCC-97H细胞的KIF20A蛋白表达量显著下降。HepG2及Huh7细胞经N-shh刺激或转染Gli2-myc后KIF20A蛋白表达水平显著增高。然而，当在HepG2中抑制Gli2的表达后阻断了N-shh对KIF20A的刺激作用，证明N-shh需要通过Gli2调控KIF20A的表达。　　第二部分：转录因子Gli2通过活化FoxM1调控KIF20A的表达　　1、在 HepG2细胞中过表达外源性的 Gli2后显著增强了 KIF20A及 Bcl2的启动子区偶联荧光素酶表达。而在HCC-LM3细胞中抑制Gli2的表达后显著抑制了KIF20A及Bcl2的启动子区偶联荧光素酶表达。　　2、通过生物信息学在线分析软件 MatInspector professional version7.2(http://www.genomatix.de/)未发现KIF20A启动子区存在Gli2潜在结合位点。但是，在KIF20A的启动子区发现了3个转录因子FoxM1的潜在结合位点（2个保守结合位点及1个周期蛋白相关保守区域CHR），而在FoxM1的启动子区发现了2个潜在的Gli2结合位点。 ChIP实验证实Gli2可以结合在FoxM1的启动子区（转录起始点上游-2165’-TCGCCACCCACG-3’-204）。FoxM1可通过周期蛋白相关保守区域CHR（转录起始点下游+3345’-TTTAAA-3’+349）结合KIF20A的启动子。　　3、将 FoxM1及 KIF20A的启动子区进行分段克隆入荧光素酶报告载体, Dual-luciferase分析证实ChIP验证的转录因子结合位点均具有功能。　　第三部分：Gli2-KIF20A信号轴调控肝癌细胞的增殖及细胞周期进程　　1、利用Western blot筛选出两个在HepG2及HCC-LM3细胞中均能有效干扰KIF20A表达的质粒。干扰KIF20A表达后HepG2及HCC-LM3细胞的增殖速率及平板细胞克隆形成能力明显减弱。　　2、细胞周期分析发现在HepG2及HCC-LM3细胞中干扰KIF20A表达后，导致细胞周期分布表现为G2/M及多核细胞比例的增加。免疫荧光及共聚焦实时活细胞拍摄技术发现干扰KIF20A表达后，肝癌细胞在有丝分裂后期分裂环内陷出现障碍，最终导致胞质分裂失败。　　3、在HepG2细胞中过表达Gli2可增强细胞增殖及克隆形成的能力，增加CyclinD1 CyclinE2, CyclinB1的表达，但干扰KIF20A后由Gli2诱导的细胞增殖效应便被阻断了。　　4、干扰Gli2及KIF20A后均能显著抑制裸鼠移植瘤的增殖能力。相应的， Western blot及IHC实验证实抑制Gli2的表达后FoxM1, KIF20A,细胞周期调控蛋白（如CyclinD1, CyclinE2及CyclinB1）及细胞增殖标志物Ki67的表达均受到显著抑制。　　第四部分：Gli2、FoxM1及KIF20A在肝癌组织中异常活化并显著影响临床预后　　1、免疫组化法检测Gli2, FoxM1和KIF20A在肝癌组织中的阳性率分别达到43.9％、56.1%及51.4%，并且三者在肝癌组织中的表达量显著高于癌旁非肿瘤组织。Western blot实验检测三者的表达趋势与免疫组化实验一致。　　2、Gli2, FoxM1及KIF20A在肝癌中两两表达呈正相关。高表达的Gli2与CA-199水平、肿瘤直径、病理分级、脉管侵犯及HBV感染相关；高表达的FoxM1与病理分级有关；高表达的 KIF20A与肿瘤直径、病理分级、脉管侵犯、HBV感染及TNM分期有关。　　3、单因素分析显示肿瘤直径、病理分级、脉管侵犯、TNM分期、Gli2、FoxM1及KIF20A表达显著影响OS及DFS。纳入多因素COX比例风险回归模型后肿瘤直径、病理分级、Gli2、 FoxM1及KIF20A表达是肝癌无病生存期的独立预后因素，而肿瘤直径、病理分级、脉管侵犯、Gli2及KIF20A表达是肝癌总生存的独立预后因素。　　结论：　　1、抑制Hh信号通路可显著抑制驱动蛋白基因KIF20A的表达，且KIF20A的mRNA水平在肝癌组织中异常升高。转录因子Gli2介导了Hh通路对KIF20A表达的调控。　　2、在肝癌细胞中 Gli2转录调控 KIF20A的表达，且 Gli2能直接转录激活FoxM1，活化的FoxM1再结合在KIF20A启动子CHR区，从而调控KIF20A的表达。　　3、KIF20A在肝癌细胞有丝分裂过程中具有重要的作用。抑制KIF20A表达后可显著阻碍肝癌细胞的有丝分裂过程，从而抑制肝癌细胞的增殖。体内外实验证实Gli2-KIF20A信号对维持肝癌细胞的增殖具有重要作用。　　4、Gli2, FoxM1及 KIF20A在肝癌组织中异常活化且共表达，提示 Gli2, FoxM1及KIF20A可作为肝细胞癌的潜在预后因子及治疗靶点。