基因免疫作为一种新的免疫手段,从它诞生的那一刻起,就带有明显的新奇性和挑战性。基因免疫可以同时诱导体液和细胞免疫反应,与病毒自然感染诱导的免疫应答十分相似。随着现代分子生物学技术的迅速发展,基因疫苗的研究从理论提出到技术成熟,又从实验室和临床前实验进入临床试验阶段,前后仅用了几年的时间。尽管基因疫苗已经安全应用于人类多个临床试验,但是也应该看到,并非所有的基因疫苗都能诱导出理想的免疫反应。基因疫苗在人体的实验结果远比小鼠等动物模型中的结果差,而且需要非常高的剂量,这给它的临床应用带来了障碍,并且不符合经济学的观点。因此,如何提高基因疫苗诱导的免疫原性,研究安全有效的基因疫苗策略,是现在免疫学和生物化学研究的热点。我们基于超分子组装化学,借鉴病毒感染细胞的自然化学过程,制备了一系列多组分的超分子组装体系,用于基因疫苗的载体研究。它们根据基因疫苗体内应用的各个屏障而设计,通过对病毒感染细胞机制的模拟,提高了基因疫苗的免疫原性。1.PLGA复合微球体系用生物可降解控释微球作为基因疫苗载体,理论上具有可长时间表达基因的活性,从而减少基因疫苗的剂量。我们把阳离子聚合物PEI引入PLGA微球,实现生物可降解控释材料(PLGA)和阳离子聚合物的协同使用:PEI存在的条件下,DNA会发生紧缩,浓缩线形的DNA成为纳米尺寸的致密颗粒,提高其物理化学稳定性,并且赋予其内涵/溶酶体释放功能;PLGA屏蔽PEI多余的正电荷,有效地逃逸补体活化,减小细胞毒性。微球较低的DNA载量和产率是PLGA微球扩大化生产的限速步骤。这里,我们发展了一种S/O/W乳化-溶剂挥发法制备了PEG-g-PEI/DNA负载的PLGA微球,以PEG-g-PEI可以和DNA形成静电复合物,PEG嵌段有多聚醚核的惰性以及刷状的多聚物群结构,具有亲溶剂性,可以让基因疫苗在有机溶剂稳定分散。以PEG-g-PEI作为DNA稳定剂,通过冷冻干燥技术冻干DNA,使内水相体积为零,从而有效提高了PLGA微球的DNA载量。2.甘露糖修饰的壳聚糖复合微球体系合成的生物可降解高分子PLGA作为控释系统的高分子载体材料取得了成功,但是作为基因疫苗的载体,其在体内的代谢产物是乳酸和羟基乙酸,导致降解过程中微球内部呈现局部酸性环境,对DNA的稳定性产生不利的影响。天然高分子作为载体有其独特的优势。我们这里建立了一个新的基于壳聚糖的体系:甘露糖修饰的壳聚糖寡聚体作为缓释材料包裹PEI/DNA复合物,用于基因疫苗的转运。该体系的成功在于:(i)甘露糖的修饰,增加了壳聚糖的水溶性,改善了其生物可降解性,并且可以识别抗原提呈细胞(APCs)表面高表达的甘露糖受体,通过受体介导的内吞进入APCs;(ii)低聚物的引入更容易实现细胞内的控释;(iii) PEI能够赋予该复合体系质子缓冲能力,依靠“质子海绵”效应,破裂内涵/溶酶体。3.壳聚糖-金纳米体系传统高分子量壳聚糖/DNA复合物高稳定性伴随着较低的体外体内基因表达水平,建议解聚(decomplexation)可能是基因转运过程的速率限制步骤。我们采用低分子量壳聚糖修饰金纳米粒子,展示了一个独特的技术平台,用于基因疫苗的转运。偶联低分子量壳聚糖到金纳米颗粒上,增加了壳聚糖的有效分子量,展现了多价离子的特征,从而增加了其对DNA的浓缩,增加其稳定性。而且,金颗粒的存在,可能起着粒子佐剂的效果,诱导抗原提呈细胞等免疫细胞聚集,从而增强免疫应答。这种基于超分子组装的金纳米微球,为基因疫苗非病毒载体的设计提供了新的技术平台。4.以磁力来增强基因疫苗的免疫原性基因疫苗肌肉注射的限速步骤极有可能是其在肌肉中无效的扩散和分布,从而导致其快速的降解失活。我们把纳米技术应用到基因免疫,基于超分子组装构建磁纳米粒子/基因疫苗复合物,利用外加磁场改善基因疫苗的肌肉内分布,提高了基因疫苗的免疫原性。若说前面三章是直接拷贝自病毒和细菌的作用过程,磁纳米技术的应用就具有原创性,这个效应是天然病毒所不具备的。我们基于超分子组装构建了一系列多组分载体,发展无生命的非自然体系,期望其呈现出的结构特征,能发挥不同于生物体但效率和选择性相当的功能。