目的:1探讨顺铂分别联合雷帕霉素、3-MA对肺腺癌A549细胞生长的抑制作用及其相关机制;2探讨顺铂分别联合雷帕霉素、3-MA对裸鼠肺腺癌A549细胞癌原位移植瘤的生长抑制作用和相关机制。方法:一对肺腺癌A549细胞的处理1将处于对数生长期的A549细胞用0.25%胰酶消化、收获、计数,调整浓度为1.0×106/ml,每孔200μl接种到96孔板中,过夜贴壁后加入雷帕霉素(RAPA,rapamycin),使其终浓度分别为0.1nmol/L,1.0nmol/L,10.0nmol/L,100.0nmol/L,未加药的对照组和加药组各设6个复孔。培养板置37℃、5%CO2孵育箱中继续培养72h后,每孔中加入MTT(浓度5mg/m L)20μL,置37℃、5%CO2孵箱中继续孵育4h,小心弃上清,每孔加入二甲基亚砜(DMSO)150μL,震荡5min,用Bio-Rad酶标仪在测试波长为570nm,滤过波长为655nm处读取吸光度(A)值。细胞增殖抑制率=(对照组平均A值-加药组平均A值)/对照组平均A值×100%抑制率(%)=(A对照-A实验)/(A对照-A空白)100%,同样的方法用于顺铂和3MA。然后用graphpad prism 5软件计算出各药物的50%细胞抑制浓度(50%inhibitory concentration,IC50),顺铂(DDP)IC50:15μmol/L,雷帕霉素IC50:10nmol/L,3-MAIC50:3μmol/L,并以此作为实验浓度。2将处于对数生长期的A549细胞用0.25%胰酶消化,将A549细胞分别以每孔1.0×106/ml密度接种于六孔培养板中,待细胞长至孔底面积约70%-80%后分别加入稀释好的药物。本实验分为四组:对照组(无任何药物干预的A549细胞)、顺铂组(在A549细胞中加15μmol/L的DDP)、顺铂+雷帕霉素组(加10nmol/L的RAPA 1h后再加15μmol/L的DDP)、顺铂+3-MA组(加3μmol/L的3-MA 1h后再加15μmol/L的DDP),分别均培养24h、48h、72h后进行检测。3细胞划痕实验分别检测用药后24h、48h、72h肺癌A549细胞生长迁移的情况。4 Real time RT-PCR法检测A549细胞经不同药物作用24h、48、72h后m TOR、LC3-Ⅱ及Bax m RNA的表达情况。5 Western blot方法检测A549细胞经不同药物作用48、72h后m TOR、LC3-Ⅱ及Bax的蛋白表达水平。二对肺腺癌A549细胞癌原位移植瘤的处理1将处于对数生长期的A549细胞用0.25%胰酶消化,调整成终浓度为1.0×107/ml,用1ml注射器注射到裸鼠右侧腋部皮下,每只0.2ml,共接种24只,饲养约15d(此时裸鼠肿瘤大小达到1cm3左右),将建立好的裸鼠肺腺癌A549细胞原位移植瘤模型随机分为4组,每组6只,即对照组(生理盐水组)、顺铂组(2mg/kg)、顺铂(2mg/kg)+雷帕霉素(1mg/kg)、顺铂(2mg/kg)+3-MA组(2mg/kg),腹腔注射给药15天,每只裸鼠注射计量为0.2ml/天,对照组和顺铂组每天注射一次,联合用药组为隔天注射一次。用药期间记录裸鼠饮食和精神状态变化,测量裸鼠体重和肿瘤大小,用药结束后处死全部裸鼠,完整剥除瘤体,测量肿瘤大小、计算肿瘤抑制率、HE染色观察肿瘤细胞形态学变化。2 Real time RT-PCR法检测A549细胞裸鼠原位移植瘤模型经药物作用后m TOR、LC3-Ⅱ及Bax m RNA的表达情况。3 Western blot方法及免疫组织化学方法检测A549细胞裸鼠原位移植瘤模型经药物作用后瘤体中m TOR、LC3-Ⅱ及Bax的蛋白表达水平。结果:一不同药物对肺腺癌A549细胞的作用1顺铂、雷帕霉素、3-MA单独作用于A549细胞时,均表现为抑制癌细胞生长的作用,且呈时间和浓度依赖性,作用时间越长,药物浓度越大,对细胞的抑制作用越强。2比较四个分组中药物对A549细胞的抑制作用:24h时间点,顺铂联合雷帕霉素对肺癌A549细胞的抑制作用最强;而48h和72h时间点,顺铂联合3-MA对A549细胞的抑制作用最强。3不同药物对A549细胞杀伤性的病理学形态观察倒置显微镜下观察A549细胞经不同实验组(对照组、顺铂组、顺铂+雷帕霉素组、顺铂+3-MA组)处理后细胞的形态变化。培养24h时细胞数目略有减少,顺铂组、顺铂+3-MA组、顺铂+雷帕霉素组对A549细胞的杀伤作用依次增强。表现为A549细胞体积变小、变圆并皱缩,折光性差,排列疏松,核浆比变大,贴壁能力减弱,有些细胞胞浆内可见较多颗粒,并出现飘浮的细胞;培养48h后细胞数目继续减少,胞浆内颗粒增多,且可见细胞碎片,贴壁细胞的数量较对照组明显减少。顺铂组、顺铂+雷帕霉素组、顺铂+3-MA组对A549细胞的杀伤作用依次增强。对照组肺癌细胞仍贴壁生长,状况良好。培养72h后细胞数目大量减少,可见明显的细胞碎片,贴壁细胞的数量较对照组显著减少。对照组肺癌细胞生长拥挤,状况欠佳。4 Real time RT-PCR结果显示(1)24h时各组(对照组,DDP组,DDP+RAPA组,DDP+3-MA组)m TOR m RNA的2-△△CT值为1.000±1.000,0.667±0.013,0.418±0.007,0.684±0.024,各用药组与对照组相比,表达量显著降低,差异均有统计学意义(P<0.05);DDP+RAPA组与DDP组相比,表达量显著降低,有统计学意义(P<0.05)。24h时各组(对照组,DDP组,DDP+RAPA组,DDP+3-MA组)LC3-Ⅱm RNA的2-△△CT值为1.000±1.000,1.489±0.031,1.686±0.069,1.376±0.033,各用药组与对照组相比,表达量显著上升,差异均有统计学意义(P<0.05);DDP+RAPA组与DDP组相比,表达量显著上升,有统计学意义(P<0.05)。24h时各组(对照组,DDP组,DDP+RAPA组,DDP+3-MA组)Bax m RNA的2-△△CT值为1.000±1.000,1.915±0.041,1.467±0.062,1.324±0.060,各用药组与对照组相比,表达量显著上升,差异均有统计学意义(P<0.05)。(2)48h时各组(对照组,DDP组,DDP+RAPA组,DDP+3-MA组)m TOR m RNA的2-△△CT值为1.000±1.000,1.796±0.003,0.732±0.007,0.645±0.008,各用药组与对照组相比,表达量显著降低,差异均有统计学意义(P<0.05);DDP+3-MA组与DDP组相比,表达量显著降低,有统计学意义(P<0.05)。48h时各组(对照组,DDP组,DDP+RAPA组,DDP+3-MA组)LC3-Ⅱm RNA的2-△△CT值为1.000±1.000,1.325±0.007,1.803±0.083,1.253±0.072,各用药组与对照组相比,表达量显著上升,差异均有统计学意义(P<0.05);DDP+RAPA组与DDP组相比,表达量显著上升,有统计学意义(P<0.05)。48h时各组(对照组,DDP组,DDP+RAPA组,DDP+3-MA组)Bax m RNA的2-△△CT值为1.000±1.000,1.346±0.080,1.133±1.125,1.864±0.104,各用药组与对照组相比,表达量显著上升,差异均有统计学意义(P<0.05);DDP+3-MA组与DDP组相比,表达量显著上升,有统计学意义(P<0.05)。(3)72h时各组(对照组,DDP组,DDP+RAPA组,DDP+3-MA组)m TOR m RNA的2-△△CT值为1.000±1.000,0.749±0.030,0.636±0.034,0.583±0.008,各用药组与对照组相比,表达量显著降低,差异均有统计学意义(P<0.05);DDP+3-MA组与DDP组相比,表达量显著降低,有统计学意义(P<0.05)。72h时各组(对照组,DDP组,DDP+RAPA组,DDP+3-MA组)LC3-Ⅱm RNA的2-△△CT值为1.000±1.000,1.428±0.080,1.836±0.056,1.153±0.011,各用药组与对照组相比,表达量显著上升,差异均有统计学意义(P<0.05);DDP+RAPA组与DDP组相比,表达量显著上升,有统计学意义(P<0.05)。72h时各组(对照组,DDP组,DDP+RAPA组,DDP+3-MA组)Bax m RNA的2-△△CT值为1.000±1.000,1.462±0.029,1.117±0.070,1.935±0.068,各用药组与对照组相比,表达量显著上升,差异均有统计学意义(P<0.05);DDP+3-MA组与DDP组相比,表达量显著上升,有统计学意义(P<0.05)。5 Western blot结果显示(1)48h各组(对照组,DDP组,DDP+RAPA组,DDP+3-MA组)m TOR的相对表达量分别为1.096±0.036,0.608±0.018,0.454±0.051,0.447±0.011,各用药组与对照组相比,表达量显著降低,差异均有统计学意义(P<0.05);DDP+3-MA组与DDP组相比,表达量显著降低,有统计学意义(P<0.05)。48h各组(对照组,DDP组,DDP+RAPA组,DDP+3-MA组)LC3-Ⅱ的相对表达量分别为0.228±0.018,0.426±0.010,0.556±0.010,0.355±0.009,各用药组与对照组相比,表达量显著上升,差异均有统计学意义(P<0.05);DDP+RAPA组与DDP组相比,表达量显著上升,有统计学意义(P<0.05)。48h各组(对照组,DDP组,DDP+RAPA组,DDP+3-MA组)Bax的相对表达量分别为0.253±0.006,0.463±0.011,0.392±0.006,0.897±0.022,各用药组与对照组相比,表达量显著上升,差异均有统计学意义(P<0.05);DDP+3-MA组与DDP组相比,表达量显著上升,有统计学意义(P<0.05)。(2)72h时各组(对照组,DDP组,DDP+RAPA组,DDP+3-MA组)m TOR的相对表达量分别为1.132±0.007,0.573±0.025,0.402±0.009,0.364±0.009,各用药组与对照组相比,表达量显著降低,差异均有统计学意义(P<0.05);DDP+3-MA组与DDP组相比,表达量显著降低,有统计学意义(P<0.05)。72h时各组(对照组,DDP组,DDP+RAPA组,DDP+3-MA组)LC3-Ⅱ的相对表达量分别为0.239±0.008,0.492±0.009,0.571±0.009,0.278±0.009,各用药组与对照组相比,表达量显著上升,差异均有统计学意义(P<0.05);DDP+RAPA组与DDP组相比,表达量显著上升,有统计学意义(P<0.05)。72h时各组(对照组,DDP组,DDP+RAPA组,DDP+3-MA组)Bax的相对表达量分别为0.248±0.006,0.581±0.007,0.287±0.009,0.916±0.005,各用药组与对照组相比,表达量显著上升,差异均有统计学意义(P<0.05);DDP+3-MA组与DDP组相比,表达量显著上升,有统计学意义(P<0.05)。二不同药物对肺腺癌A549细胞裸鼠原位移植瘤的作用1 24只裸鼠均成瘤,成瘤率为100%。用药期间各组(对照组,DDP组,DDP+RAPA组,DDP+3-MA组)裸鼠饮食及精神状态未见明显异常;用药前各组裸鼠体重差异无统计学意义(17.4±2.1g,18.6±2.7g,18.9±1.9g,17.8±2.1g,P>0.05),用药后第一天测量各组裸鼠体重,差异无统计学意义(29.1±1.2g,29.4±0.9g,29.7±1.3g,18.9±2.6g,P>0.05)。药物治疗期间各组(对照组,DDP组,DDP+RAPA组,DDP+3-MA组)裸鼠肿瘤体积的肿瘤大小分别为1.110±0.035,0.705±0.033,0.623±0.042,0.500,肿瘤的抑制率分别为0%,36.5%,43.9%,55.0%,与对照组相比,差异均有统计学意义(P<0.05)。2各组裸鼠原位移植瘤形态学观察结果:显微镜下观察HE染色切片,裸鼠原位移植瘤的瘤组织呈低分化肺腺癌,癌细胞异形性明显,核大深染,细胞形态多样,核染色质呈粗颗粒状。3 Real time RT-PCR结果显示:(1)各组(对照组,DDP组,DDP+RAPA组,DDP+3-MA组)m TOR m RNA的2-△△CT为1.000±1.000,0.753±0.007,0.635±0.008,0.593±0.012,各用药组与对照组相比,表达量显著降低,差异均有统计学意义(P<0.05);DDP+3-MA组与DDP组相比,表达量显著降低,有统计学意义(P<0.05)。(2)各组(对照组,DDP组,DDP+RAPA组,DDP+3-MA组)LC3-Ⅱm RNA的2-△△CT为1.000±1.000,1.316±0.006、1.733±0.007,各用药组与对照组相比,表达量显著上升,差异均有统计学意义(P<0.05);DDP+RAPA组与DDP组相比,表达量显著上升,有统计学意义(P<0.05)。(3)各组(对照组,DDP组,DDP+RAPA组,DDP+3-MA组)Bax m RNA的2-△△CT为1.000±1.000,1.323±0.008,0.1.178±0.010,1.756±0.024,各用药组与对照组相比,表达量显著上升,差异均有统计学意义(P<0.05);DDP+3-MA组与DDP组相比,表达量显著上升,有统计学意义(P<0.05)。4 Western blot结果显示:(1)各组(对照组,DDP组,DDP+RAPA组,DDP+3-MA组)m TOR的相对表达量分别为1.290±0.028,0.694±0.017,0.522±0.002,0.485±0.004,各用药组与对照组相比,表达量显著降低,差异均有统计学意义(P<0.05);DDP+3-MA组与DDP组相比,表达量显著降低,有统计学意义(P<0.05)。(2)各组(对照组,DDP组,DDP+RAPA组,DDP+3-MA组)LC3-Ⅱ的相对表达量分别为0.330±0.008,0.581±0.008,0.685±0.008,0.383±0.005,各用药组与对照组相比,表达量显著上升,差异均有统计学意义(P<0.05);DDP+RAPA组与DDP组相比,表达量显著上升,有统计学意义(P<0.05)。(3)各组(对照组,DDP组,DDP+RAPA组,DDP+3-MA组)Bax的相对表达量分别为0.258±0.006,0.594±0.008,0.296±0.008,0.919±0.020,各用药组与对照组相比,表达量显著上升,差异均有统计学意义(P<0.05);DDP+3-MA组与DDP组相比,表达量显著上升,有统计学意义(P<0.05)。5免疫组织化学结果:各组(对照组,DDP组,DDP+RAPA组,DDP+3-MA组)m TOR免疫反应积分中位数为8,6,5,4,各用药组与对照组相比,表达量显著降低,差异均有统计学意义(P<0.05);DDP+3-MA组与DDP组相比,表达量显著降低,差异有统计学意义(P<0.05)。各组(对照组,DDP组,DDP+RAPA组,DDP+3-MA组)LC3-Ⅱ免疫反应积分中位数为2,4,6,3,各用药组与对照组相比,差异均有统计学意义(P<0.05);DDP+RAPA组与DDP组相比,表达量显著上升,有统计学意义(P<0.05)。各组(对照组,DDP组,DDP+RAPA组,DDP+3-MA组)Bax的免疫反应反应积分中位数为2,5,3,7,各用药组与对照组相比,表达量显著上升,差异均有统计学意义(P<0.05);DDP+3-MA组与DDP组相比,表达量显著上升,有统计学意义(P<0.05)。结论:一不同药物对肺腺癌A549细胞的作用1顺铂联合雷帕霉素、顺铂联合3-MA均可以对A549细胞生长产生抑制作用,且该作用大于单独使用顺铂对癌细胞造成的抑制作用。2顺铂联合雷帕霉素与顺铂联合3-MA相比,24h时前者的对肺癌A549细胞的抑制作用大于后者,而48h和72h时结果相反。3顺铂+雷帕霉素组在24h时间点LC3-Ⅱ表达显著高于其它组,而在48h和72h顺铂+3-MA组Bax表达显著升高。提示早期顺铂+雷帕霉素组可能因自噬占据细胞死亡的主导地位,而后期(顺铂+3-MA组)可能因抑制自噬反而激活凋亡,使癌细胞大量死亡。二不同药物对肺腺癌A549细胞裸鼠原位移植瘤的作用顺铂+雷帕霉素组、顺铂+3-MA组均可以抑制肺腺癌A549细胞裸鼠移植瘤的生长,且抑制作用均大于单独使用顺铂时对肿瘤的抑制作用。提示雷帕霉素、3-MA均可以提高顺铂的化疗敏感性。