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目的:黏细菌是研究多细胞结构形态发生机制的良好模型。FruA是黏细菌发育所必需的一种转录因子,其mRNA5′端存在相当长的由235个核苷酸组成的非翻译区(5′-UTR),如此长的5′-UTR在细菌乃至真核生物中并不多见。本项目通过对fruAmRNA5′非翻译区的突变研究,明确5′-UTR在fruA表达中的作用。目前在转录后水平研究黏细菌基因表达调控鲜有报道,作为黏细菌多细胞形态发生和细胞分化关键性的蛋白因子之一,全面、准确地阐明fruA时空特异性表达的调节机制可以增进对黏细菌这一模式生物发育程序分子调控的认识。
方法:以lacZ为报告基因构建了保留或缺失5′-UTR的2种fruA-lacZ翻译融合体,此外,还对5′-UTR的4个区域进行连续的缺失突变(△5-55,△56-109,△110-164,△165-220)。分别将6种fruA-lacZ翻译融合体整合在野生型黄色黏细菌DK1622染色体的attB位点。这些fruA-lacZ翻译融合体具有相同的启动子、启动子上游调节元件和翻译信号(SD序列及起始密码子),lacZ均连接在fruA第6个密码子下游,不同之处仅在于各自5′-UTR的完整性存在差异。Southern杂交确认后测定β-半乳糖苷酶在发育进程中的表达状况,结合5′-UTR二级结构预测来进一步分析5′-UTR对fruA-lacZ表达调控的结构基础。
结果:5′-UTR各种缺失突变经DNA测序分析得到证实。Southem杂交分析表明,6种fruA-lacZ翻译融合载体均准确整合在野生型黄色黏细菌DK1622染色体的attB位点。5′-UTR自+4至+220整体性缺失后fruA-lacZ在发育阶段完全不表达,4种区域性缺失也明显抑制报告基因的表达,但对5′-UTR二级结构的影响程度不一。
结论:(1)fruAmRNA5′-UTR是自身基因发育特异性表达所必需的。(2)5′-UTR至少在56-109区域存在顺式作用元件。